應用液液萃取分析中度烘烤橡木片中揮發(fā)性化合物*

周雙，徐巖，范文來，李記明，于英，姜文廣，李蘭曉

1(教育部工業(yè)生物技術重點實驗室，江南大學釀酒科學與酶技術研究中心，釀造微生物與應用酶學研究室，江蘇 無錫，214122)2(張裕集團公司技術中心，山東煙臺，264000)

陳釀是葡萄酒發(fā)酵結束后的重要工藝。陳釀過程中，葡萄酒在香氣、顏色、口感等方面上發(fā)生重要變化。主要原因是橡木桶中一些重要化合物轉移到葡萄酒中，如橡木中的酚醛類和揮發(fā)性酚類等賦予葡萄酒特有的特征風味，增強其風味復雜性［1］。另外，它們對于葡萄酒香氣和風味的貢獻已有相關文獻報道［2］:順、反式威士忌內酯(木味、椰子味)，糠醛(干果味)及其衍生物，酚醛類化合物如丁香醛、香蘭素(香草味)，揮發(fā)性酚類化合物如丁香酚(煙熏味)、愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚等［3］。

橡木風味主要表現(xiàn)于揮發(fā)性成分的種類與組成，橡木揮發(fā)性成分測定的預處理包括液液萃取(LLE)［4］、頂空固相微萃取(HS-SPME)［5］、加速溶劑萃取(ASE)［6］、減壓蒸餾［7］、同時蒸餾萃取(SDE)［8］等。液液萃取是最傳統(tǒng)的方法，無需復雜儀器設備，處理樣品量大，回收率較高;可以實現(xiàn)大量樣品的濃縮，有利于極微量化合物的發(fā)現(xiàn)。2009年，Simoón等人［4］利用液液萃取與GC-MS聯(lián)用在法國、美國和西班牙的橡木中檢測到110種揮發(fā)性化合物。

目前，我國葡萄酒生產(chǎn)主要采用法國與美國進口橡木，隨著我國葡萄酒產(chǎn)量逐年增長，以及國際競爭加劇，研究與開發(fā)國產(chǎn)橡木勢在必行。為加速橡木國產(chǎn)化進程，分析我國橡木存在的優(yōu)勢與不足，本研究采用液液萃取方法研究我國橡木的揮發(fā)性成分，進行定性、定量分析，并與歐美橡木進行差異比較。

1 材料與方法

1.1 樣品和試劑

橡木樣品:由張裕公司提供，3個樣品分別是法國、美國與中國的中度烘烤橡木片，各1批次。

試劑:無水乙醇(上海安譜科學儀器有限公司，色譜純)，無水二氯甲烷、NaCl、無水Na2SO4(上海國藥集團，分析純)，鑒定中標明有保留指數(shù)(RI)的化合物(Sigma-Aldrich公司，色譜純)。

1.2 主要儀器

氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 Agilent GC 6890－5975 mass selective detector(MSD)、氣相色譜 Agilent GC(美國安捷倫公司);DC－12氮氣吹掃儀(上海安譜科學儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 揮發(fā)性化合物的提取

橡木片中揮發(fā)性化合物的提取參照Chatonnet等人［9］的實驗方法。將2 g橡木片樣品浸泡在100 mL酒精水溶液中(12%乙醇，0.7 g/L酒石酸，1.11 g/L酒石酸氫鉀)。在室溫、黑暗條件下浸提15 d，每天定時搖瓶1次。過濾，濾液中添加內標和無水NaCl飽和，用45 mL二氯甲烷液液萃取3次，每次15 mL。合并有機相，用無水硫酸鈉干燥過夜，氮吹，濃縮至250 μL，GC-MS 分析。

1.3.2 GC-MS分析

色譜條件:FFAP極性柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)分離揮發(fā)性化合物。氣相色譜進樣口和檢測器溫度都為250℃，載氣為氦氣，流速為2 mL/min;進樣量為1 μL，不分流進樣;升溫程序為:初溫50℃，保持 2 min，以 6℃/min升至 230℃，230℃保持 10 min。

質譜條件:EI電離源，電子轟擊能量為70 eV，離子源溫度為230℃;掃描范圍為35～350 amu。

1.3.3 化合物鑒定

揮發(fā)性化合物的定性通過質譜庫檢索與標準品的保留指數(shù)(RI)比對鑒定，沒有標準品的化合物通過與NIST 05質譜庫(Agilent Technologies Inc.)中標準譜圖以及文獻中報道的保留指數(shù)RIL進行比對鑒定。

1.3.4 化合物定量

采用選擇離子(SIM)方法定量，以2-辛醇(終濃0.58 mg/L)、γ-己內酯(終濃度 2.11 mg/L)、鄰香蘭素(終濃 1.37 mg/L)、3，4-二甲基苯酚(終濃 0.02 mg/L)為內標進行定量分析。沒有標準品的組分半定量。

2 結果與討論

2.1 橡木片中揮發(fā)性化合物鑒定

橡木片酒精浸提液GC-MS分析檢測到85種化合物，包括2種萜烯醇類、1種醛類、7種有機酸類、2種酯類、3種內酯類、7種芳香族類、6種酮類、15種呋喃類、34種酚類，以及8種其他化合物。與國內研究文獻［7］相比，發(fā)現(xiàn)了更多的酚酮類化合物，如香草乙酮、4-羥基-3-甲氧基苯丙酮等10種酚酮類化合物;另外，新檢測到4種呋喃酮類化合物，包括3-甲基-2(5H)-呋喃酮、5-乙氧基二氫-2(3H)-呋喃酮、2(5H)-呋喃酮和5-乙?；?2(3H)-呋喃酮。發(fā)現(xiàn)了更多的痕量化合物，如2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯酮、高香茅醇、茴香醛、乙酰氧基-2-丁酮等各類揮發(fā)性化合物。

2.2 呋喃類化合物

呋喃類化合物是橡木中一類重要的化合物，共檢測到15種，包括糠醛及其衍生物、2-糠醛縮二乙醇、2，5-二甲酰基呋喃、糠醇、糠酸、糠酸乙酯等，以及在國產(chǎn)橡木中首次檢測到的4種呋喃酮化合物，如2(5H)-呋喃酮等，其質量濃度在幾μg/g到幾百μg/g之間。呋喃類化合物在橡木中的總質量濃度最高的是法國橡木(811.40 μg/g)，中度烘烤的法國橡木中糠醛達430.62 μg/g，另外，質量濃度高的還有5-甲基糠醛與5-羥甲基糠醛，其中糠醛和5-甲基糠醛在葡萄酒中的感官閾值分別是20 mg/L和45 mg/L［10］，估計在葡萄酒中風味貢獻有限?？啡┯砂肜w維素的主要成分戊糖產(chǎn)生，而5-羥甲基呋喃和5-甲基呋喃主要是由纖維素的己糖產(chǎn)生［4］。2-糠醛縮二乙醇曾經(jīng)在國產(chǎn)東北烘烤橡木片中檢測到［8］，該化合物是在浸泡液的酸性條件下，由糠醛與乙醇發(fā)生縮醛反應而產(chǎn)生［11］。

表1 橡木提取液中揮發(fā)性化合物的檢測(μg/g橡木)

續(xù)表1

續(xù)表1

2.3 揮發(fā)性酚類化合物

在橡木中，共檢測到34種揮發(fā)性酚類化合物，是橡木中種類最多、最重要的揮發(fā)性化合物，中度烘烤的中國橡木中酚類化合物具有最高的總質量濃度(1 125.5μg/g)，其中香蘭素質量濃度達到455.04 μg/g，包括羥基酚類、單甲氧基苯酚類、雙甲氧基苯酚類以及三甲氧基苯酚類共四類酚類化合物，它們的結構式如圖1所示。

圖1 四類揮發(fā)性酚類化合物的結構式

羥基酚類化合物主要是苯酚及其衍生物，極其微量。

單甲氧基苯酚類化合物主要包括愈創(chuàng)木酚及其衍生物，丁香酚及其異構體，以及賦予橡木特有香草風味的香蘭素;其中愈創(chuàng)木酚和4-甲基愈創(chuàng)木酚具有煙熏香氣，與其烘烤香氣有一定相關性［12］。異丁香酚可以賦予葡萄酒橡木特征［13］。另外，4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的感官閾值分別是140 μg/L、380 μg/L［10］，橡木提取液中的質量濃度遠低于其感官閾值。雙甲氧基苯酚類包括2，6-二甲氧基苯酚及其衍生物，以及丁香醛、松柏醛與芥子醛。2，6-二甲氧基苯酚是具有煙熏香［3］。三甲氧基苯酚類只檢測到3，4，5-三甲氧基苯酚，該化合物是一種重要的醫(yī)藥中間體［14］。

10種酚酮類化合物首次在國產(chǎn)橡木中檢測到，如香草乙酮、4-羥基-3-甲氧基苯丙酮、1-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-2-丙酮等，它們的質量濃度較高，都含有愈創(chuàng)木基、紫丁香基等木質素單體結構，是木質素降解物，與木質素在風干和烘烤過程中的降解密不可分［15］。這類化合物對于橡木風味的影響，鮮有報道，但其質量濃度較高，對于風味貢獻有待研究。

此外，揮發(fā)性酚類化合物中的香蘭素和丁香醛是橡木中重要的化合物［7］，其質量濃度較高，在中國中度烘烤的橡木中分別達到455.04 μg/g和300.26 μg/g，換算它們在橡木提取液中的質量濃度分別為9100.8 μg/L 和 6005.2 μg/L，而葡萄酒中的感官閾值分別為 320 μg/L 和 50 000 μg/L［10］;前者香氣活性值(OAV)為28，表現(xiàn)出強烈的香草香;后者OAV小于1。橡木中木質素的降解主要是由于烘烤過程中的高溫(高于120℃)導致的［16］。

2.4 內酯類化合物

在橡木中檢測到3種內酯類化合物，γ-丁內酯、順、反式威士忌內酯，結構式如圖2所示。

圖2 兩種威士忌內酯異構體的結構式

威士忌內酯是橡木中的重要香氣物質，具有椰子香氣和新鮮木頭的氣味［1］。威士忌內酯有兩種異構體，在葡萄酒中的感官閾值分別是順式威士忌內酯為67 μg/L、反式威士忌內酯為 790 μg/L［17］。Wilkinson等人研究了由前體3-甲基-4-羥基辛酸產(chǎn)生β-甲基-γ-辛內酯的反應過程［18］。而另一觀點認為威士忌內酯是由木頭中脂類化合物的熱降解而產(chǎn)生;并隨著烘烤的進行，降解反應同時發(fā)生［19］。

2.5 其他常見化合物

橡木中檢測到7種揮發(fā)性有機酸，總質量濃度在美國橡木中達到最高(300.61 μg/g)，包括乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、辛酸、棕櫚酸，其中以乙酸、丙酸質量濃度較高。

7種芳香族化合物分別是苯甲醛、苯乙酮、2-羥基苯甲醛、苯甲醇、苯乙醇、茴香醛、苯甲酸，它們是具有芳香特性的化合物，但在橡木中極其微量，低于其嗅覺閾值，而不能在橡木提取液中呈現(xiàn)其風味特征。

橡木中的酮類化合物種類較少，質量濃度較低，如 3-羥基-2-丁酮、1-羥基-2-丁酮、2-辛酮、2-壬酮、1-乙酰氧基-2-丙酮、1-乙酰氧基-2-丁酮，其中1-乙酰氧基-2-丙酮相對于其余酮類化合物具有較高的質量濃度(57.25 μg/g)，對橡木風味的貢獻有待驗證。

其他化合物還包括2種萜烯醇類、1種醛類、2種環(huán)酮類、2種酯類、1種吡咯類、1種吡喃類，以及4種未知化合物。其中高香茅醇、3-氧代-α-紫羅蘭醇極其微量;己醛對于橡木香氣是不協(xié)調的異味化合物［15］。檢測到的2種環(huán)酮類微量成分3-乙基-2-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和 2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯酮是橡木烘烤后形成的，具有烘烤香、焦香，是橡木烘烤的特征香［20］。另外，還有己酸乙酯、棕櫚酸乙酯，2-吡咯甲醛和麥芽酚。在未鑒定的4種化合物中，峰56、60、63都含有特征離子m/z=43。

2.3 不同產(chǎn)地橡木比較

對法國、美國與中國橡木進行初步比較，可以發(fā)現(xiàn):首先，不同產(chǎn)地橡木中的順、反式威士忌內酯之比不同。法國橡木為0.89，美國橡木7.68，中國橡木8.58。通常認為法國橡木順式與反式威士忌內酯之比小于2，美國橡木的比例大于5。從目前結果可以看出，中國橡木與美國橡木更為接近，比法國橡木含有更多的順式威士忌內酯［21］。

從呋喃類化合物質量濃度比較也得出同上的結論，即中國橡木更類似于美國橡木。法國橡木呋喃類化合物質量濃度(811.40 μg/g)比中國橡木(475.66 μg/g)和美國橡木(423.39 μg/g)高，而中國橡木與美國橡木相似;其中中度烘烤的法國橡木中糠醛的質量濃度高達 430.62 μg/g，而美國橡木中只含有171.09 μg/g，中國橡木為 268.26 μg/g，法國橡木中糠醛質量濃度是美國橡木的2.52倍，中國橡木的1.61倍。

香蘭素、丁香醛兩種重要的風味化合物在三種橡木中具有較大的差異。中國中度烘烤的橡木質量濃度達455.04 μg/g，是法國、美國橡木的3～4倍，賦予中國橡木提取液特有的香草氣味。中度烘烤的美國和法國橡木中的香蘭素質量濃度相差僅為17.59 μg/g，比較接近，這與橡木組成和烘烤過程是密切聯(lián)系的。相比較而言，中國橡木與歐美橡木各有特色。

3 結論

采用液液萃取與氣相色譜-質譜聯(lián)用技術研究分析橡木中的揮發(fā)性成分，具有無需復雜設備，萃取溶劑便宜，處理樣品量大，大幅度濃縮樣品，發(fā)現(xiàn)更多微量化合物等優(yōu)點，是一種適合橡木樣品前處理的方法。在橡木中共檢測到85種化合物，包括2種萜烯醇類、1種醛類、7種有機酸類、2種酯類、3種內酯類、7種芳香族類、6種酮類、15種呋喃類、34種酚類，以及8種其他化合物。如香蘭素、丁香醛、糠醛、2-糠醛縮二乙醇、5-甲基糠醛、愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、順、反式威士忌內酯、乙酸等重要的風味化合物。從呋喃類、橡木內酯、香蘭素和丁香醛等化合物比較看，中國橡木與美國橡木更加類似。

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