纖維水解液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸研究進展

吳瓊，謝慧，王風芹，任天寶，宋安東

(河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南鄭州，450002)

琥珀酸，學名丁二酸，是一種常見的天然有機酸，除了存在于琥珀中外，還存在于人體、動物、植物和微生物中。琥珀酸是TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物之一，在生物代謝中占有非常重要的位置。作為一種重要的碳四平臺化合物，琥珀酸是多種重要的中間產(chǎn)物和專業(yè)的化學制品，廣泛應用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、塑料等行業(yè)。在2004年美國能源部公布的12種最有潛力的大宗產(chǎn)品中，琥珀酸排第一位［1］。琥珀酸也是公認為繼檸檬酸和乳酸后的下一個大規(guī)模生產(chǎn)的有機酸產(chǎn)品［2］。估計全球琥珀酸的總產(chǎn)銷量為1～2萬t，而全世界琥珀酸及其衍生物的市場潛在容量每年在27萬t左右。

傳統(tǒng)的琥珀酸生產(chǎn)方法是依賴以石油為主的化石能源為原料來化學合成琥珀酸。目前，國際市場上琥珀酸的年需求量已超過15 000 t，年增長速率平均為6%～10%，售價為14 000～16 000元/t，它們大部分是通過石化法生產(chǎn)得到的。然而，隨著全球能源危機的不斷加劇，導致石化法生產(chǎn)琥珀酸的成本逐年攀高，從而抑制了琥珀酸的發(fā)展?jié)摿?。新興的發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸以其低的能耗、高環(huán)保性和原料的可持續(xù)利用性而受到越來越多科學家們的重視。日本三井物產(chǎn)株式會社首創(chuàng)以玉米淀粉為起始原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的工藝，其年產(chǎn)在5 000 t左右。美國應用碳化學公司早在2002年就采用微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)琥珀酸，目前年產(chǎn)量為5 000 t。歐洲最大的淀粉及其衍生物生產(chǎn)商Roquette公司也在2009年將琥珀酸推向了商業(yè)化。

木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源，據(jù)估計木質(zhì)纖維質(zhì)原料占世界生物質(zhì)量(100億～500億t)的50%。我國是一個有著豐富植物纖維資源(如農(nóng)作物秸稈、林產(chǎn)品加工業(yè)下腳料等)的國家，每年僅玉米秸稈一項就超過1.7億t［3］。中國每年浪費或低利用的纖維材料總共約10億t，其中農(nóng)作物秸稈一項約7億t，其主要成分為纖維素和半纖維素，它們都可通過水解的方法降解成相應的低分子糖，進而利用微生物發(fā)酵來大規(guī)模的轉(zhuǎn)化制備琥珀酸等生物基化工產(chǎn)品，產(chǎn)業(yè)前景相當廣闊［4］。若能以農(nóng)作物秸稈水解液為主要原料產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)琥珀酸，將會有效減少現(xiàn)今琥珀酸發(fā)酵對淀粉原料的依賴性，并且降低了原料成本［5］。這不僅擺脫了對化石能源的依賴，而且開辟了溫室氣體CO2利用的新途徑，使琥珀酸成為未來最重要的生物基化工產(chǎn)品之一［6］。

1 纖維水解液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸工藝流程和目前水平

發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的研究始于20世紀80年代，美國能源部在20世紀90年代初聯(lián)合Argonne National Laboratory等4個國家級實驗室以及應用碳化學公司，投資700萬美元來進行琥珀酸的發(fā)酵與提取計劃的研究(W－31－109－Eng－38)［7］。國內(nèi)在這方面的研究還處于起步階段。蘇溧［8］等以葡萄糖為原料，在血清瓶中發(fā)酵24 h琥珀酸產(chǎn)量達8.3 g/L，在5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)、葡萄糖質(zhì)量濃度分別為10 g/L和100 g/L時，琥珀酸的產(chǎn)量分別達到8.2 g/L和45.6 g/L。目前國內(nèi)外所報道的利用發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的最高產(chǎn)量為 110 g/L［9］。

纖維水解液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的過程首先是將纖維質(zhì)原料(如玉米秸稈、玉米籽皮、玉米芯等)利用物理或化學的預處理方法破壞纖維質(zhì)原料的內(nèi)部結構;再加入水解酶或能產(chǎn)生水解酶的微生物使纖維質(zhì)原料充分轉(zhuǎn)化為低分子糖類如葡萄糖和木糖等，最后通過微生物的發(fā)酵過程來生產(chǎn)琥珀酸。其工藝流程如圖1。Kim［10］等利用木材水解液作為產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌(Mannheimia succiniciproducens)的碳源，發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，產(chǎn)量為11.73 g/L。Lee［11］等利用木質(zhì)水解液生產(chǎn)琥珀酸的最終產(chǎn)量達24 g/L。姚嘉旻［12］等通過稀酸水解玉米芯制備琥珀酸，產(chǎn)量最高可達35.2 g/L。目前，對纖維水解液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的研究主要集中在工程菌株的定向選育、發(fā)酵微生物的代謝工藝優(yōu)化和纖維水解液脫毒工藝方面。李興江［13］等通過軟X射線誘變和代謝調(diào)控發(fā)酵菌株，最終利用秸稈水解液為原料使五、六碳糖共代謝產(chǎn)琥珀酸量達68.7 g/L。吳昊［14］等通過對玉米籽皮稀酸水解液脫毒處理后所產(chǎn)琥珀酸量達到43.2 g/L。

圖1 纖維水解液生產(chǎn)琥珀酸工藝流程圖

2 纖維水解液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸相關微生物

菌種在發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的過程中占有重要的地位。琥珀酸是一些厭氧和兼性厭氧微生物代謝途徑中的共同中間物［7］。大多數(shù)琥珀酸產(chǎn)生菌都是從反芻動物的瘤胃中分離得到，如丙酸鹽生產(chǎn)菌、典型的胃腸細菌及瘤胃細菌都能夠分泌琥珀酸。目前的研究集中在產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)、大腸桿菌(E.coli)和產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens)這3類菌上，前二者為兼性厭氧菌，發(fā)酵過程需要經(jīng)過好氧和厭氧兩個階段，在好氧階段需消耗底物以獲得較高的細胞密度，在厭氧階段才能達到高產(chǎn)琥珀酸;后者為專性厭氧菌，且不耐高濃度的底物，故限制了其工業(yè)生產(chǎn)前景，在最優(yōu)條件下(pH 6.2，高濃度CO2)，以葡萄糖為原料，其琥珀酸產(chǎn)量可達到35 g/L。近幾年也有通過構建工程菌株使大腸桿菌在完全好氧的條件下來發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的報道。表1列出了一些在發(fā)酵應用中報道較多且產(chǎn)量較高的琥珀酸產(chǎn)生菌發(fā)酵方式和琥珀酸產(chǎn)量狀況的比較。

利用纖維水解液為原料產(chǎn)琥珀酸的微生物目前以產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)為主。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)是從動物的瘤胃中分離得到的一種革蘭氏陰性菌，經(jīng)16s rRNA鑒定為巴斯德菌科放線桿菌屬。葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、木糖等都是這類微生物可以利用的碳源，并能夠耐受高濃度的琥珀酸鹽。以葡萄糖為底物時，發(fā)酵產(chǎn)物中主要有琥珀酸、乙酸以及少量的甲酸和乙醇。CO2的固定和利用對該菌種的琥珀酸產(chǎn)量有較大的影響，同時該菌種還能夠利用外源氫氣作為電子供體，并以富馬酸作為電子受體，以葡萄糖做底物在一般條件下琥珀酸的最終發(fā)酵產(chǎn)量可達50 g/L，而當使用100%氫氣時，琥珀酸產(chǎn)量最高可達110 g/L［9］。李興江［15］等通過對琥珀酸放線桿菌產(chǎn)琥珀酸代謝工藝的優(yōu)化，得到以農(nóng)作物秸稈為原料發(fā)酵琥珀酸產(chǎn)量最高達73 g/L。雖然目前對該菌種的研究還較少，但該菌已是迄今為止報道耐高糖和高鹽的菌種，并已初步具備工業(yè)化生產(chǎn)的能力［16］。此外，產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens)有報道稱也可以利用纖維水解液，琥珀酸產(chǎn)量可達 24 g/L［17］。Lee［18－20］等連續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌(Mannheimia succiniciproducens)利用木質(zhì)纖維素水解液為碳源連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸得率為55%，生產(chǎn)能力3.19 g/(L·h)，在連續(xù)發(fā)酵條件下的生產(chǎn)能力也是目前報道的最高值，顯示了良好的應用前景。由于傳統(tǒng)菌株產(chǎn)琥珀酸能力還不強，近年來也有學者研究利用基因工程手段獲取高產(chǎn)琥珀酸的重組大腸桿菌。邢建民［21］等利用重組大腸桿菌ptsG突變株以玉米秸稈水解液為原料生產(chǎn)琥珀酸，產(chǎn)量達57.81 g/L。

表1 幾種主要的琥珀酸高產(chǎn)菌株發(fā)酵方式和產(chǎn)量狀況的比較

3 琥珀酸發(fā)酵生產(chǎn)代謝途徑和菌種選育

菌種的代謝途徑對琥珀酸的產(chǎn)量有著至關重要的影響。發(fā)酵法制備琥珀酸的過程是將EMP途徑中得到的PEP經(jīng)由TCA循環(huán)的還原支路，通過一步CO2固定和兩步還原反應生成琥珀酸，該過程涉及的關鍵酶有磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、蘋果酸脫氫酶、富馬酸酶和富馬酸還原酶［25］。圖2是產(chǎn)琥珀酸放線桿菌和產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌的代謝途徑。在厭氧條件下微生物通過PEP羧化激酶和PEP羧化酶途徑固定CO2產(chǎn)生琥珀酸;在好氧條件下也可通過異檸檬酸酶產(chǎn)生少量的琥珀酸［2］。磷酸烯醇式丙酮酸、草酰乙酸、蘋果酸、富馬酸是產(chǎn)琥珀酸放線桿菌產(chǎn)琥珀酸代謝途徑中的4種關鍵代謝副產(chǎn)物。而大腸桿菌產(chǎn)琥珀酸的代謝途徑較為復雜，且只能通過TCA循環(huán)中的還原支路生成琥珀酸，故琥珀酸的產(chǎn)量較低。圖3是大腸桿菌的琥珀酸代謝途徑。構建產(chǎn)琥珀酸的重組大腸桿菌已成為目前琥珀酸發(fā)酵生產(chǎn)中的研究熱點。Vemuri［24］等將編碼丙酮酸羧化酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌AFP111(AFP111/pTrc99A-pyc)中，通過好氧與厭氧兩步發(fā)酵76 h，以葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸量可達99.2 g/L，見表1。這也是產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌研究中一個突破性的進展，在目前眾多工程菌株中，該菌株也是發(fā)酵法制備琥珀酸最具工業(yè)價值的。Lee［26］等通過基因敲除獲得了不形成副產(chǎn)物的代謝工程菌，以葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸水平達到52.4 g/L，比野生菌有了大幅度的提高。于麗［27］等還研究了重組大腸桿菌 JM001(△ppc)/pTrc99a-pck以葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的性能，結果表明厭氧條件下產(chǎn)酸能力為對照菌株JM001的15.3倍。此外，Guettler等人［9］以產(chǎn)琥珀酸放線桿菌130Z(Actinobacillus succinogenes)為出發(fā)菌株，篩選出抗單氟乙酸的自發(fā)突變株FZ53。以葡萄糖為底物，發(fā)酵84h后可產(chǎn)琥珀酸量達66.4 g/L，而在最適條件下，此菌株的琥珀酸產(chǎn)量可以達到80～110 g/L，發(fā)酵時間48h，得率高達97%，而且乙酸等副產(chǎn)物極少，并能耐一定濃度的鹽溶液，具備了初步工業(yè)化生產(chǎn)的能力。McKinlay［28］等還通過 NMR和 GC-MC分析13C原子標記的代謝中間產(chǎn)物，對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌130Z的代謝途徑和代謝流進行了修正，最終證明了在高CO2和H2濃度下產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的琥珀酸產(chǎn)量的增加和甲酸、乙酸和乙醇副產(chǎn)物的減少。國內(nèi)研究中，李興江［13］等通過軟X射線誘變選育乙酸及乳酸代謝阻斷突變株，降低了乳酸和乙酸的代謝流量。同時，通過添加少量的檸檬酸鹽可間接促使琥珀酸代謝流量的增加，最終使得以纖維水解液為原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸量達到68.7 g/L。黃秀梅［25］等通過外源添加一些代謝中間體提高了產(chǎn)琥珀酸放線桿菌HMP和EMP代謝途徑的通量比，解決了琥珀酸合成過程中還原力不足的矛盾。此外，一些金屬離子和維生素也會對琥珀酸放線桿菌產(chǎn)琥珀酸的代謝途徑產(chǎn)生影響。李興江［15］等通過研究一些金屬離子和維生素的添加濃度，最終得到利用纖維水解液為原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸量為58 g/L。

圖2 產(chǎn)琥珀酸放線桿菌和產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌的代謝途徑

圖3 大腸桿菌的琥珀酸代謝途徑

4 纖維水解液生產(chǎn)琥珀酸發(fā)酵條件優(yōu)化

4.1 CO2對琥珀酸發(fā)酵的影響

琥珀酸發(fā)酵過程是典型的厭氧發(fā)酵。無論是以葡萄糖為原料還是以纖維水解液為原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，CO2和H2對琥珀酸的代謝有著重要的作用，直接影響琥珀酸的產(chǎn)生［29］。增大CO2濃度和(或)H2的濃度，可提高琥珀酸的產(chǎn)量。研究表明，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌130Z的培養(yǎng)基中CO2水平低時，琥珀酸產(chǎn)量會減少。因此，當前研究者大多采用在發(fā)酵罐中持續(xù)不斷地通入CO2的發(fā)酵工藝，以保證琥珀酸產(chǎn)生菌對CO2的固定，這也是琥珀酸發(fā)酵工藝中與其他有機酸發(fā)酵所不同的地方［30］。發(fā)酵過程中外源供給CO2的形式可以是碳酸鹽也可以是CO2氣體。在培養(yǎng)基中添加碳酸鹽可以與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸反應，釋放出CO2用于合成琥珀酸，同時還可調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值;以CO2氣體作為CO2供體時，則還需流加堿液以中和發(fā)酵過程所產(chǎn)生的琥珀酸等有機酸。陳可泉［31］等在對 Actinobacillus succinogenes NJ113 的研究表明，以CO2氣體作為CO2供體，底物為葡萄糖時菌體生長、CO2固定效率、琥珀酸產(chǎn)率以及琥珀酸得率均優(yōu)于碳酸鹽。李興江［32］等通過單因素試驗和神經(jīng)網(wǎng)絡分析得出以秸稈水解液為原料發(fā)酵琥珀酸的最佳條件為:CO2體積含量62%、H2體積含量5.4%及生物素微量濃度為7.8 mmol/L時，產(chǎn)酸最高為75.8 g/L。PEP羧化激酶是產(chǎn)琥珀酸放線桿菌厭氧合成琥珀酸代謝途徑中的關鍵酶［33］。它參與了對CO2的固定并直接影響著后續(xù)代謝環(huán)節(jié)的進行和琥珀酸的產(chǎn)量。理論上每生成1 mol琥珀酸需要消耗1 mol CO2。如果將發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸與其它能產(chǎn)生CO2的生產(chǎn)過程(如發(fā)酵生產(chǎn)乙醇)進行耦合，不僅可將釋放的CO2加以利用，實現(xiàn)多種產(chǎn)物聯(lián)產(chǎn)，而且還可減少溫室氣體的排放。在微生物固定CO2產(chǎn)生琥珀酸的反應過程中，培養(yǎng)基中的碳酸鹽含量、發(fā)酵液的pH值、溫度、攪拌轉(zhuǎn)速及等均可影響到CO2的固定過程［31，34］。因此，通過優(yōu)化和控制發(fā)酵培養(yǎng)的條件，可以增強CO2的固定效果，從而提高琥珀酸的產(chǎn)量。Guttler［35］等通過考察得出了Actinobacillus succinogenes 130Z的最適生長和產(chǎn)酸pH值為6.8。同時，固體碳酸鹽也是調(diào)節(jié)pH值的理想物質(zhì)。陳可泉［31］等在5 L發(fā)酵罐中對Actinobacillus succinogenes NJ113進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，得到結果表明，以CO2氣體作為CO2供體，葡萄糖為原料，通氣量為0.75 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)溫度為37℃，pH值是6.6時為最佳條件，其最終CO2固定速率達到0.6 g/(L·h)，琥珀酸產(chǎn)率達到 1.61 g/(L·h)。Mark［34］等還研究了重組大腸桿菌AFP111以葡萄糖為底物時固定CO2的最適pH值為6.4，此外，作者還研究得出NO2、O2、CO和SO2這些氣體的少量存在并不會引起琥珀酸產(chǎn)量的減少。利用基因工程手段也可對CO2的固定過程進行改造，通過增強琥珀酸代謝途徑中關鍵酶的表達和敲除或失活琥珀酸競爭途徑中的酶基因來提高琥珀酸的產(chǎn)量。Kim［36］等利用基因重組技術，將琥珀酸放線桿菌中丙酮酸羧化酶基因pck在已敲除ppc基因的突變菌株大腸桿菌K.12 ppc中過量表達，結果表明過量表達丙酮酸羧化酶最終使琥珀酸的產(chǎn)量提高了6.5倍［37］。

4.2 培養(yǎng)基對琥珀酸發(fā)酵的影響

不同碳源的培養(yǎng)基對提高琥珀酸產(chǎn)量影響不大，主要是控制接種量和加入適量的 Na+和 Mg2+［38］。目前，培養(yǎng)基優(yōu)化方面的研究主要以葡萄糖為底物進行優(yōu)化。而以纖維水解液為原料進行的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究還非常欠缺。鄭璞［39］等對琥珀酸放線桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化后，得到以葡萄糖為原料產(chǎn)琥珀酸的量為41.69 g/L。此外，加入一定量的碳酸鈉可提高大腸桿菌AFP18的產(chǎn)酸率［40］。

4.3 發(fā)酵方式對琥珀酸發(fā)酵的影響

發(fā)酵方式對于在工業(yè)化生產(chǎn)中提高琥珀酸的產(chǎn)量有著重要的影響。目前以纖維水解液為原料發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的發(fā)酵方式多為分批式發(fā)酵，而補料發(fā)酵還研究較少。鄭璞［41］等以秸稈水解液作為原料，對比了分批與補料兩種方式發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，其產(chǎn)量分別為45.5 g/L和53.2 g/L。董晉軍［42］等還利用菊芋原料以同步糖化補料分批發(fā)酵的方式生產(chǎn)琥珀酸，最終產(chǎn)量達98.2 g/L，發(fā)酵效果明顯優(yōu)于糖化后發(fā)酵。

5 纖維水解液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸脫毒工藝

纖維水解液作為琥珀酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵原料，是經(jīng)過物理或化學的預處理方法處理后所得到的。這個過程會發(fā)生一系列反應，產(chǎn)生大量的色素和有機酸、糠醛、多酚類等化合物，水解液呈黑褐色，這些物質(zhì)都屬于發(fā)酵抑制物，影響細胞的生長與代謝，必須加以脫除。目前，報道最多且最常用的方法是活性炭脫毒。姜岷［43］等研究了稀酸水解玉米皮制備琥珀酸發(fā)酵糖液的工藝條件，其水解液經(jīng)活性炭脫色后，在厭氧條件下發(fā)酵表明玉米皮水解液可替代葡萄糖作為琥珀酸發(fā)酵的碳源。吳昊［14］等利用活性炭脫毒后的玉米籽皮水解液發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸，得到的琥珀酸產(chǎn)量達42.3 g/L。同時，水解液的脫色率為92.27%，糠醛脫除率75%，5-羥甲基糠醛脫除率53%，多酚類化合物脫除率98%，總糖損失低于5%。此外，黃秀梅［5］等利用活性炭和Ca(OH)2同時使用去除玉米秸稈水解液中的發(fā)酵抑制物，使琥珀酸的產(chǎn)量達到66.23 g/L，抑制物糠醛及羥甲基糠醛(HMF)的去除率分別為91.11%、89.83%，而總糖損失率僅為5.57%。

6 面臨問題及展望

琥珀酸作為一種優(yōu)秀的化學平臺產(chǎn)品，用途廣泛。通過生物轉(zhuǎn)化法，經(jīng)過合理的過程優(yōu)化，具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α＠美w維水解液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸不僅綠色環(huán)保，而且可以緩解當前所面臨的糧食危機和溫室氣體CO2引起的溫室效應。目前，發(fā)酵法大量生產(chǎn)琥珀酸還面臨著很多潛在的問題，具體主要有以下幾個方面:

(1)以纖維水解液為原料的發(fā)酵條件優(yōu)化方面還有待研究，尤其是發(fā)酵培養(yǎng)基條件的優(yōu)化。目前，以纖維水解液為原料發(fā)酵琥珀酸的研究主要集中在菌種代謝調(diào)控方面，發(fā)酵條件的優(yōu)化方面還研究很少。由于纖維水解液中成分復雜且含有多種有毒物質(zhì)，抑制琥珀酸產(chǎn)生菌的生長和代謝。因此，獲得一種以纖維水解液為原料的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基條件對琥珀酸的產(chǎn)量有著重要的影響。

(2)發(fā)酵過程難以達到厭氧環(huán)境，甚至發(fā)酵用水也須經(jīng)過脫氣處理，這在工業(yè)化生產(chǎn)中較難實現(xiàn)。若解決了控制厭氧條件難的問題，將會大幅降低發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的成本。

(3)琥珀酸高產(chǎn)菌株的選育還不足。篩選或構建一株能用于工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株是今后研究的熱點。目前對大腸桿菌的基礎研究較透徹，其生長代謝速度快，是最有潛力的改造菌株，但產(chǎn)酸能力差，發(fā)酵困難，基因工程構建菌株耗資多，菌株易退化，工業(yè)生產(chǎn)還有一定難度［1］。發(fā)酵同時產(chǎn)生大量雜酸也是亟待解決的問題。利用基因工程技術改造大腸桿菌基因來達到高產(chǎn)琥珀酸將在未來受到重視。

隨著能源危機和糧食安全問題的日益嚴重，利用纖維質(zhì)原料來生產(chǎn)琥珀酸在經(jīng)濟性、環(huán)境性、社會性等方面都具有巨大的優(yōu)勢。盡管目前全世界琥珀酸的市場需求量還不是很高，但一直處于快速增長狀態(tài)。據(jù)2006年韓國Song［44］等報道丁二酸酯及聚酯的潛在市場將達到每年2 700萬t。很多國家和科研院所都對纖維水解液生產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)進行了評估和探索，相信利用纖維水解液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)業(yè)化會在未來取得顯著的發(fā)展。

［1］王金主，袁建國，王元秀，等.發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的研究進展［J］.食品與醫(yī)藥，2010，12(1):55 －59.

［2］鄭璞，孫志浩，倪嘩，等.微生物發(fā)酵琥珀酸的研究進展［J］.生物技術通報，2008，S1:95 －101.

［3］韓魯佳，劉向陽，胡金有，等.中國農(nóng)作物秸稈資源及其利用現(xiàn)狀［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2002，18(3):87 －91.

［4］Gopal Chotani，Tim Dodge，Amy Hsu，et al.The commercial production of chemicals using pathway engineering［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2000，1 543:34 －455.

［5］黃秀梅，李建，陳可泉，等.利用玉米秸稈水解液厭氧發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的研究［J］.中國釀造，2009(6):31－34.

［6］Lee J W，Lee S Y，Song H，et al.The proteome of Mannheimia succiniciproducens，a capnophilic rumenbacterium ［J］.Proteomics，2006，6(12):3 550 －3 566.

［7］王慶昭，趙學明.琥珀酸發(fā)酵菌種研究進展［J］.生物工程學報，2007，23(4):570 －575.

［8］蘇溧，陳可泉，蔡婷，等.Actinobacillus succinogenes130Z厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸條件初步研究［J］.生物加工過程，2007，5(2):67 －72.

［9］Guettler MV，JainMK，Rumler D.Method for making succinic acid，bacterial variants for use in the process，and methods for obtainingvariants.1996，US 5573931［p］.

［10］Kim D Y，Yim S C，Lee P C，et al.Batch and continuous fermentation of succinic acid from wood hydrolysate by Mannheimia succiniciproducens MBEL55E［J］.Enzyme and Microbial Technology，2004，35(6 －7):648 －653.

［11］Lee P C，Lee S Y，Hong S H，et al.Biological conversion of wood hydrolysate to succinic acid by Anaerobiospirillum succiniciproducens［J］.Biotechnology Letters，2003，25:111－114.

［12］姚嘉旻，姜岷，吳昊，等.稀酸水解玉米芯制備琥珀酸［J］.生物加工過程，2010，8(3):66 －72.

［13］李興江，姜紹通，潘麗軍，等.秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸高產(chǎn)菌株的選育及其代謝調(diào)控［J］.化工學報，2008，59(12):3 017－3 114.

［14］吳昊，姚嘉旻，劉宗敏，等.玉米籽皮稀酸水解液脫毒發(fā)酵制備琥珀酸的可行性［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2009，25(2):267－272.

［15］李興江，羅水忠，姜紹通，等.農(nóng)作物秸稈發(fā)酵制備琥珀酸的代謝工藝優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2008，24(12):161－167.

［16］Zeikus JG，Jain MK，Elankovan P.Biotechnology of succinic acid production and markets for derived industrial products［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1999，51:545 －552.

［17］Lee P C，Lee W G，Lee S Y，et al.Fermentative production of succinic acid from glucose and corn steep liquor by Anaerobiospirillum succiniciproducens［J］.Biotechnol Bioprocess Eng，2000，5(5):379 －381.

［18］Lee P C，Lee S Y，Hong S H，et al.Biological conversion of wood hydrolysate to succinic acid by Anaerobiospirillum succiniciproducens［J］.Biotechnol Lett，2003，25:111 －114.

［19］Lee PC，Lee SY，Hong SH，et al.Batch and cont inuous cultures of Mannheimia succiniciproducens MBEL55E for the production of succinic acid from whey and corn steep liquor［J］.Bioprocess Biosyst Eng，2003，26(1):63 －67.

［20］Hong SH，Kim JS，Lee SY，et al.The genome sequence of thecapnophilic rumen bacterium Mannheimia succiniciproducens［J］.Nat Biotechnol，2004，22(10):1 275 － 1 281.

［21］Dan Wang，Qiang Li，Maohua Yang，et al.Efficient production of succinic acid from corn stalk hydrolysates by a recombinant Escherichia coli with ptsG mutation［J］.Process Biochemistry，2011，46:365 －371.

［22］Lee P C，Lee S Y，Hong S H，et al.Isolation and characterization of a new succinic acid-producing bacterium，Mannheimia succiniciproducens MBEL55E，from bovine rumen［J］.Appl Microb Biotechnol，2002，58:663 － 668.

［23］Lee P C，Lee W G，Lee S Y，et al.Succinic acid production with reduced by-product formation in the fermentation of Anaerobiospirillum succiniciproducens using glycerol as a carbon source［J］.Biotechnol Bioeng，2001，72(1):41－48.

［24］Vemuri G N，Eiteman M A，Altman E.Succinate production in dual-phase Escherichia coli fermentations depends on the time of transition from aerobic to anaerobic conditions［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2002，28:325－332.

［25］黃秀梅，姜岷，李建，等.外源添加代謝中間體對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌厭氧發(fā)酵制備丁二酸的影響［J］.生物工程學報，2010，26(9):1 249 －1 256.

［26］Lee SJ.Appl Environ Microbiol［M］.2006，72:1 939 －1 948.

［27］于麗，馬江鋒，岳方方，等.產(chǎn)琥珀酸重組大腸桿菌的發(fā)酵性能研究［J］.中國生物工程雜志，2010，30(9):43－48.

［28］McKinlay JB，Shachar HY，Zeikus JG，et al.Determining Actinobacillus succinogenes metabolic pathways and fluxes by NMR and GC-MS analyses of13C-labeled metabolic product isotopomers［J］.Metab Eng，2007，9(2):177 －192.

［29］張玉秀，張云劍，李強.產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的研究進展［J］.中國生物工程雜志，2008，28(12):102－106.

［30］武敏敏，劉宏娟，張建安，等.發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸研究進展及其應用前景［J］.現(xiàn)代化工，2010(11):33－37.

［31］陳可泉，姜岷，蘇溧，等.產(chǎn)琥珀酸放線桿菌固定CO2制備琥珀酸［J］.化學工程，2009，37(1):49 －52.

［32］李興江，潘麗軍，姜紹通.秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸工藝的神經(jīng)網(wǎng)絡分析［J］.食品科學，2008，29(8):471 －474.

［33］Oh I J，Lee H W，Park C H，et al.Succinic acid production by continuous fermentation process using Mannheimia succiniciproducens LPK7［J］.Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，18(5):908 －912.

［34］Eiteman M A.Final technical report:Process design for the biocatalysis of value-added chemicals from carbon dioxide［R］.DOE，US.2007.

［35］McKinlay J B，Zeikus J G，Vieille C.Insights into Actinobacillus succinogenes fermentative metabolism in a chemically defined growth medium［J］.Applied and Environmental Microbiology，2005，71:6 651 －6 656.

［36］Kim P，Laivenieks M，Vieille C，et al.Effect of overexpression of Actinobacillus succinogenes phosphoenolpyruvate carboxykinase onsuccinate production in Escherichia coli［J］.Applied and Environmental Microbiology，2004，70(2):1 238－1 241.

［37］姜岷，馬江鋒，陳可泉，等.重組大腸桿菌產(chǎn)琥珀酸研究進展［J］.微生物學通報，2009，36(1):120 －12.

［38］Lee P C，Lee M G，Kwon S，et al.Effects of medium components on the cell growth of Anaerobiospirillum succiniciproducens and succinic acid production［J］.Process Biochem，1999，35(1):49 －55.

［39］鄭璞，朱蕾蕾，劉宇鵬，等.琥珀酸放線桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.工業(yè)微生物，37(5):1－5.

［40］Andersson C，Helmerius J，Hodge D，et al.Inhibition of succinic acid production in metabolically engineered Escherichia coli by neutralizing agent，organic acids，and osmolarity［J］.Biotechnol Prog，2009，25(1):116 －123.

［41］Zheng Pu，Dong Jin-Jun，Sun Zhi-Hao，et al.Fermentative production of succinic acid from straw hydrolysate by Actinobacillus succinogenes［J］.Bioresource Technology，2009，100:2 425 －2 429.

［42］董晉軍，鄭璞，倪曄，等.菊芋原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸［J］.食品與生物技術學報，2008，27(5):78－82.

［43］姜岷，姚嘉曼，吳昊，等.稀酸水解玉米皮制備琥珀酸發(fā)酵糖液的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，33(10):6 －9.

［44］Song H，Lee S Y.Production of succinic acid by bacterial fermentation［J］.Enzyme Microb Technol，2006，39:352－361.