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    NF-κB和Cx32在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)

    2012-11-21 02:48:34羅愛華黃小敏曾湖李雄
    中國實用醫(yī)藥 2012年12期
    關(guān)鍵詞:胞漿肝細(xì)胞分化

    羅愛華 黃小敏 曾湖 李雄

    細(xì)胞間隙連接是普遍存在于組織中的一種細(xì)胞連接形式,通過Cx介導(dǎo)的細(xì)胞間連接通訊,對細(xì)胞的增殖、分化進(jìn)行調(diào)控。間隙連接由相鄰細(xì)胞膜上的連接子相互銜接而成,連接子的蛋白質(zhì)亞單位即間隙連接蛋白。間隙連接功能缺陷可能是腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。研究Cx32在正常肝中的表達(dá),進(jìn)一步探討與肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生的關(guān)系[1]。采用免疫組織化學(xué)探討NF-κB和間隙連接蛋白Cx32在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)特征。分析其表達(dá)與肝癌臨床病理特點之間的關(guān)系,檢測NF-κB與Cx32表達(dá)水平有助于判斷肝癌惡性程度和預(yù)后。

    1 材料與方法

    1.1 材料 收集我科2007~2010年間肝細(xì)胞癌手術(shù)標(biāo)本48例,平均年齡45.4歲,正常肝組織為肝膽管結(jié)石切除肝組織12例。根據(jù)2000年WHO消化道腫瘤肝癌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類。肝細(xì)胞癌分為4級,Ⅰ級2例,Ⅱ級32例,Ⅲ級8例,Ⅳ級6例。

    1.2 免疫組化染色和判斷標(biāo)準(zhǔn) 送檢標(biāo)本取材制片,切片脫蠟至水,高溫高壓法5 mi抗原修復(fù)。修復(fù)后阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,用PBS作為陽陰性對照,PBS水洗后加一抗,4℃孵育過夜,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水,透明,封片。SP試劑盒為上海太陽生物公司產(chǎn)品。染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):采用半定量法評估組織免疫組反應(yīng)強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率。細(xì)胞核和/(或)胞漿著色最深為3分,無色為0分,兩者之間為1或2分。每張切片選擇10個典型視野,將免疫反應(yīng)的平均強(qiáng)度視為此例的免疫反應(yīng)強(qiáng)度。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,分別采用多因素方差(MANOVA)分析、Kruskal-Wallis H檢驗和Nemenyi檢驗,P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

    表1 Cx32蛋白在HCC及正常肝中陽性率

    2 結(jié)果

    2.1 Cx32蛋白的表達(dá) 分別檢測每例標(biāo)本Cx32蛋白的表達(dá),陽性染色表達(dá)定位于胞漿和胞膜上,肝硬化組織中胞漿陽性為主88.91%(11/12),反應(yīng)強(qiáng)度高。Cx32在HCC組織中有不同程度的表達(dá)。HCC陽性細(xì)胞以胞漿內(nèi)彌漫、均勻分布為主,也可見胞膜陽性,染色較淡。經(jīng)χ2檢驗,Cx32在HCC中陽性率明顯低于其在肝正常組織的陽性率(P<0.01),隨著HCC分化程度降低,其陽性率有所下降,比較結(jié)果見表1。

    2.2 NF-κB蛋白的表達(dá) 陽性染色表達(dá)定位于胞核,本研究結(jié)果顯示,NF-κB在正常肝組織及HCC組織中表達(dá)分別為21.34%(3/12),71.28%(34/48)(P <0.01)。同時 NF-κB 在高中低分化HCC組織中的表達(dá)率有顯著差異(P<0.05)并與臨床TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05),表明肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展與NF-κB的高表達(dá)有顯著相關(guān)性,提示NF-κB活化后,進(jìn)入胞核,通過抑制細(xì)胞的調(diào)亡從而調(diào)控腫瘤的生長,調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)肝癌的發(fā)生。

    3 討論

    細(xì)胞間隙連接是相鄰細(xì)胞之間形成的一種能夠開放和關(guān)閉的親水性膜通道結(jié)構(gòu),由跨膜的細(xì)胞間隙連接蛋白(connexin,Cx)構(gòu)成,只能透過相對分子質(zhì)量通道的直徑約為1.5~2.0<1000的分子和離子,如Ca2+、cAMP、三磷酸肌醇、葡萄糖、維生素及其他參與生長調(diào)節(jié)的物質(zhì)可以通過間隙連接為相鄰細(xì)胞所共有,而蛋白質(zhì)、RNA、多糖和脂質(zhì)復(fù)合物等大分子物質(zhì)則不能透過間隙連接通道,不同組織、細(xì)胞之間通過間隙連接,進(jìn)行信息溝通,平均代謝產(chǎn)物,使各種信息有效的達(dá)到相應(yīng)的細(xì)胞,保持細(xì)胞群體對生長刺激和調(diào)節(jié)反應(yīng)的同步性,使細(xì)胞的增值、分化按正常的程序進(jìn)行[2-4]。Mesnil M[5]研究表明,用Cx基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞,使其重建細(xì)胞間隙連接,恢復(fù)GJIC可以延緩腫瘤細(xì)胞生長。在Warn-Cramer[6]的實驗中,Martyn將CxcDNA轉(zhuǎn)染至小鼠永生化細(xì)胞后,并為建立功能性細(xì)胞間隙連接通訊,但仍然抑制細(xì)胞增殖。本研究表明,Cx32在肝細(xì)胞及HCC細(xì)胞中均存在不同程度的表達(dá),既定位于胞漿內(nèi),又有胞膜陽性,或二者同時陽性,與國外文獻(xiàn)報道相符合。研究發(fā)現(xiàn),Cx32在正常肝細(xì)胞中有較高水平的表達(dá)(88.91%),陽性細(xì)胞深染。在HCC組織低表達(dá)(37.50%),且染色強(qiáng)度明顯減弱。Cx32的表達(dá)減弱與正常肝、至HCC的惡性進(jìn)程密切相關(guān)。

    研究同時對Cx32在HCC及其癌旁肝中的表達(dá)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)Cx32在二者中的表達(dá)陽性率明顯不同。癌周肝細(xì)胞的高強(qiáng)度表達(dá)與HCC細(xì)胞淡染甚至無陽性染色,形成明顯對比,顯示癌旁肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞間生物性質(zhì)不同。進(jìn)一步證實Cx32表達(dá)異常與HCC的形成及其惡性特征有關(guān)。

    在不同分化的HCC組織中,Cx32的表達(dá)也存在差別,在HCCⅠ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級中的陽性率分別為 100%、40.62%、25.20%、16.66%,(P<0.01),提示分化程度降低,Cx32的表達(dá)水平逐漸下降,表達(dá)率有顯著差異。

    現(xiàn)有同類研究已明確,間隙連接通訊功能的缺陷以間隙連接基因表達(dá)的異常為基礎(chǔ),從而對腫瘤的惡性增殖和轉(zhuǎn)化進(jìn)行調(diào)控。對細(xì)胞生長、增殖、分化、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等起著重要的調(diào)節(jié)作用[7]。有認(rèn)為Cx32基因的穩(wěn)定表達(dá)可能有抑瘤用,可能具有重要抑癌因基。本研究提示,Cx32表達(dá)下降可能是HCC的發(fā)生的重要環(huán)節(jié),其分子機(jī)制尚需研究。NF-κB在正常肝組織及HCC組織中表達(dá)分別為21.34%(3/12),71.28%(34/48)(P<0.01)。同時NF-κB在高中低分化HCC組織中的表達(dá)率有顯著差異(P<0。05)并與臨床TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05),表明肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展與NF-κB的高表達(dá)有顯蓍相關(guān)性,同時檢測NF-κB與Cx32表達(dá)水平有助于判斷肝細(xì)胞癌惡性程度和預(yù)后。

    [1]Karin M.NF-kappa B and cancer:mechanisms and targets.Mol Carcinog,2006,45(6):355-361.

    [2]Karin M,Ben-Neriah Y.Phosphorylation meets ubiquitination:the control of NF-KB activity.Annu Rev Immunol,2000,l8(1):621-663.

    [3]Konstantinopoulos PA,Vandoros GP,Sotiropoulou-Bonikou G,et al.NF-kappa B/PPAR gamma and/or AP-1/PPAR gamma'on/off'switches and induction of CBP in colon adenocarcinomas:correlation with COX-2 expression.International Journal of Colorectal Disease,2007,22(1):57-68.

    [4]Baldwin AS.Series introduction:the transcription factor NF-kappa B and human disease.J Clin Invest,2001,107(1):3-6.

    [5]Mesnil M.Connexins and cancer.Biol Cell,2002,94:493-500.

    [6]Warn-Cramer BJ,Lin R,Martyn K,et al.Maintaining connexin 43 gap junctional communication in v-Src cells does not alter growth properties associated with the transformed phenotype.Cell Commun Adhes,2003,10:299-303.

    [7]Tano T,F(xiàn)ujinoto E,Habiwara H,et al.Connexin 32 as an anti-invasive and anti-metastatic gene in renal cell carcinoma.Biol Pharm Bull,2006,29(10):1991-1994.

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