不同氮素水平對甜菜硝酸還原酶和亞硝酸還原酶活性的影響

杜永成，王玉波，范文婷，蓋志佳，于敦爽，谷 維，張俐俐，馬鳳鳴*

(1東北農業(yè)大學農學院，黑龍江哈爾濱150030;2黑龍江省農業(yè)科學院作物營養(yǎng)實用技術研究所，黑龍江哈爾濱150086)

NO3－在植物體內先還原成NH4+，最后才能轉化為植物體可直接利用的有機物谷氨酰胺［1］。目前已知，由NO3－還原成NH4+這一代謝過程需要由硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)和亞硝酸還原酶(nitrite reductase，NiR)參與完成。而NR及NiR與光合都有著極為密切的聯系，NR是一種光誘導酶，并且硝酸還原反應的進行需要NADH提供還原力［2－3］，而 NADH 正是由光反應產生的 NADPH 轉換而來;NiR則是直接需要光反應中產生的鐵氧還蛋白(Fd)才能進行還原反應［4］，將NO2－還原成NH4+。前人對 NR 進行了大量細致的研究［5－11］，但是對NiR的研究鮮有報道。

由于NR在植物體內的生成受硝態(tài)氮的誘導，而NR與NiR在氮代謝中以偶聯調節(jié)的形式對氮代謝進行調節(jié)，因此本試驗以甜菜品種KWS0143為材料，通過施用不同硝態(tài)氮水平對甜菜體內NR活力、NiR活力、葉綠素總含量以及生育期內光合速率的動態(tài)變化進行研究，對硝態(tài)氮與NR活力、NiR活力、葉綠素總含量及光合速率間關系進行分析，從而進一步探索甜菜的氮代謝過程。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2009～2010年在東北農業(yè)大學科研實習基地進行，土壤類型為黑土，耕層土壤基礎肥力為:有機質含量26.4 g/kg、全氮1.55 g/kg、全磷0.348 g/kg、緩效鉀888 mg/kg、堿解氮189.2 mg/kg、速效磷28.9 mg/kg、速效鉀272 mg/kg、pH 6.47。

試驗設 0、60、120、180 kg/hm24個氮素水平，分別以N0、N60、N120、N180表示。供試肥料為硝酸鈣(含N 13%)，以基肥的形式一次施用。采用框栽栽培方式(框深0.5 m)，框區(qū)內規(guī)格為行長8 m、行距0.7 m、株距0.23 m，5行區(qū)，面積為28 m2。5次重復，隨機區(qū)組排列。

供試甜菜品種為KWS0143。試驗于4月20日人工播種，10月2日收獲，管理同大田。

1.2 測定指標及方法

從長出第6片真葉時(6月6日)開始取樣，每隔15 d左右在晴朗天氣的上午8:00～10:00，每處理隨機取三株，對其完全展開的功能葉片進行光合速率的測定，然后將植株整株出土放入冷藏箱帶回實驗室。葉片部分取樣方法為自內向外選取完全展開的功能葉數片，去葉脈剪碎混勻用以測定葉綠素含量及酶活性。塊根部分取樣方法為將塊根切成小片混勻用以測定酶活性。

光合速率的測定:采用Photosynthesis System CI－310(CID.inc U.S.A)。儀器初始設定為 Open System(開放葉室)，Single(單次測量)，葉室面積6.5 cm2，設定流量為0.4 L/min，反應時間10 s。于光合穩(wěn)定時進行3次測定，取平均值。每株甜菜測定2片葉，每處理測定3株，取平均值。

葉綠素(a+b)總含量的測定按郝再彬等［12］的方法。加80%丙酮提取，于波長663 nm、645 nm下測定光密度值并代入公式計算。葉綠素總含量Ct=8.05 A663+20.29 A645，其中，Ct為葉綠素濃度，以μg/mL表示。

硝酸還原酶(NR)活性的測定:參照于海彬等［13］的方法，分別測定內源與外源基質條件下的甜菜葉片NR活力，即enNRA與exNRA。NR活性用NO2－μg/(g·h)，FW表示。

亞硝酸還原酶(NiR)活性的測定:參照Rajasekhar等［14］和 Kenjirou 等［15］的方法，略有改動。NiR活性用NO2－μg/(g·h)，FW表示。

含糖率的測定:將取樣器由根頸和根頭部交界處依45°角方向插入根內取樣，樣品置于壓榨鉗中壓出汁液，用折光法進行測定［16］。

1.3 數據分析

數據采用DPS 7.05系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 光合速率、葉綠素總含量、NR和NiR活性的動態(tài)變化

2.1.1 甜菜葉片光合速率的動態(tài)變化 甜菜葉片光合速率呈單峰曲線變化，峰值在塊根增長初期(8月7日)。不同處理的葉片光合速率變化趨勢基本一致。N0處理的光合速率在各取樣時期均最低。在同一取樣時期，4個處理表現為N180≈N120＞N60＞N0(圖1)。

2.1.2 甜菜葉片中葉綠素總含量的動態(tài)變化 在幼苗期，甜菜葉片葉綠素總含量較高，隨后下降，至葉叢形成初期(7月8日)升至最高水平其后緩慢下降(圖2)。這可能是因為幼苗期(6月6日)甜菜葉片新生，所以有較高的葉綠素含量;在葉叢形成期，葉片形態(tài)建成，以增大單位面積光合能力為主，所以葉綠素含量最高;甜菜葉片的旺盛生長(7月)結束后，生長中心逐漸下移，同時葉片開始出現衰老，新生葉片少于衰老葉片，導致葉綠素含量逐漸下降。不同處理的葉片葉綠素總含量變化趨勢基本一致。在同一取樣時期，各處理間葉綠素含量差異較大，其中N0處理的含量在整個取樣時期均最低。

2.1.3 甜菜葉片中NR活性的動態(tài)變化 NR活性在整個生育期間呈雙峰曲線變化(圖3)。6月上旬(苗期)出現第一個NR活性高峰，此時幼苗6片真葉完全展開，之后酶活性下降，7月上旬降至最低，在7月下旬(葉叢形成末期或塊根增長初期)出現第二個NR活性高峰，隨后NR活性又下降，在9月中旬(糖分積累期)又出現一個微弱的高峰。在生育期間出現兩次NR高峰，此結果與李文華［17］的試驗結果相一致。這兩個時期正是氮素的代謝旺盛期，在苗期，根系分化，地上部也在迅速進行器官建成，需要較高的NR活性促進NO－3吸收和轉化，用來提供較多的氨基酸、蛋白質供器官建成;葉叢形成期，甜菜正處于生育盛期，葉叢形成與塊根增長相重疊，生長中心開始由葉部轉至根部，功能葉片NR活性的適當高值并協同氮代謝的其它酶，既為形成繁茂葉叢，又為塊根增大提供結構蛋白。此后，9月中旬的微弱高峰可能是由于老葉枯死，新葉剛剛長出的緣故。

內源、外源基質條件下甜菜葉片NR活性的變化趨勢基本上一致，在苗期活性最高，葉叢形成末期出現第二個高峰，峰值遠小于苗期。各生育時期，外源基質NR(exNR)活性均高于內源基質NR(enNR)活性，二者的差值在苗期大于甜菜生育后期。在同一取樣時期，各氮水平間NR活性差異較大，各生育時期均為高氮處理的酶活性大于低氮處理的酶活性。enNR活性反映的是甜菜營養(yǎng)生長的生物學特性，即為甜菜葉片對氮素的真實還原速率，而exNR活性反映的是葉片對NO－3的可利用強度和植株細胞代謝庫中NO－3的狀況，即葉片對氮素的還原潛力，實際上是間接地反映了甜菜葉片內NR酶量的多少。以上結論可以說明，在甜菜生育前期，NR的還原潛力遠遠高于生育后期。

圖3 不同氮素水平下內源、外源基質條件下甜菜葉片NR活性的變化Fig.3 Dynamics of NR(enNR、exNR)activities of sugar beet leaves under different nitrogen levels

2.1.4 甜菜葉片和塊根中NiR活性的動態(tài)變化 甜菜葉片中NiR活性在整個生育期間基本呈“M”型曲線變化(圖4)，幼苗期活性較低，6月22日(苗期)出現第一個NiR活性高峰，隨后酶活性開始下降，在7月份(葉叢形成期)酶活性持續(xù)最低，在8月7日NiR活性出現第二個高峰，峰值較第一個峰值稍有降低，隨后9月上旬(糖分積累期)NiR活性緩慢下降，在9月下旬酶活性又稍有回升，幅度較小。在生育前期地上部生長較快，氮素代射旺盛，而較多的結構蛋白和酶蛋白完成光合器官的建成，較高的酶活性有利于氮素的吸收和轉化，促進葉叢生長;生育后期，酶活性顯著減弱，對氮素吸收減少，氮代謝維持在較低水平，有利于蔗糖的合成和積累。同NR相似，不同氮水平處理的葉片NiR活性具有一致的變化趨勢。在同一取樣時期，氮水平之間NiRA差異較大，各生育時期葉片酶活性均表現為高氮處理大于低氮處理，且無氮處理的酶活性最低。

圖4 甜菜葉片NiR活性的動態(tài)變化Fig.4 Dynamics of NiR activities in sugar beet leaves

苗期塊根中NiR活性最低，幾乎測不到酶活力，整個生育期間呈雙峰曲線變化(圖5)。塊根NiR酶活性從苗期開始逐漸升高，至塊根增長初期(8月7日)出現第一個高峰，這與葉片中NiR活性變化同步，隨后酶活性下降，直至8月25日最低，在9月中旬有一個小回升。各生育時期內，塊根NiR活性均低于葉片NiR活性，二者的差值在苗期大于甜菜生育后期。根中兩個NiR活性高峰皆在生育后期(塊根增長期和糖分積累期)，這主要是由于生育后期根是甜菜的生長中心，根中氮代謝旺盛。

圖5 甜菜塊根NiR活性的動態(tài)變化Fig.5 Dynamics of NiR activities in sugar beet roots

2.2 氮素水平對甜菜產量、含糖率及產糖量的影響

由表1知，甜菜產量隨施氮水平的增加而提高，N180水平時產量最高，達到63.94 t/hm2;含糖率則正好相反，隨施氮水平的增加而降低，N0處理的含糖率最高，為17.01%;由于產量的極顯著提高伴隨著含糖率的顯著降低，所以N120水平的產糖量最高，為9567.94 kg/hm2。 因此，在農業(yè)生產中，考慮成本以及經濟效益，適宜的施氮量極為重要。產量及產糖量的結果也符合光合速率的變化規(guī)律(圖1)，高氮水平下的高光合速率為產量的提高提供了條件。本研究中產量、含糖率以及產糖量隨氮水平的變化規(guī)律與馬鳳鳴和高繼國［18］的研究結果基本一致。

表1 氮肥對甜菜產量、含糖率以及產糖量的影響Table 1 Effects of the nitrogen fertilization on yield，sugar content and sugar yield of sugar beet

2.3 氮素與葉綠素含量、NR活性、NiR活性的相關關系

相關性分析結果(表2)表明，氮素與葉綠素總含量、NR活性、NiR活性皆表現為正相關關系，NRA和NiRA在各時期均表現為顯著正相關關系。氮素與葉綠素總含量在生育后期表現為極顯著正相關，主要是由于生育后期葉片開始走向衰老，葉綠素逐漸降解，而氮素能夠一定程度地延緩功能葉片衰老，減慢葉綠素降解過程，此結果與黃兆峰等［19］的研究結論一致。由于NR、NiR是誘導酶，所以氮素與兩種酶活性在全生育期都表現出顯著正相關或極顯著正相關關系。

2.4 葉綠素含量與酶活性的相關關系

相關性分析結果(表3)表明，葉綠素總含量與葉片NR、NiR酶活性和塊根NiR酶活性均表現為正相關關系，葉叢形成初期相關極顯著(P＜0.01)，生育后期相關達顯著或極顯著水平。葉叢形成末期和塊根形成初期相關系數明顯變小。

表2 不同生育時期施氮量與測定指標的相關分析Table 2 Correlation analysis between different N levels and the tested indexes at different growth periods

表3 不同生育時期葉綠素總含量與酶活性的相關分析Table 3 Correlation analysis between total content of chlorophyll(a+b)and different enzyme activities in sugar beet at different growth periods

3 討論

植物的光合作用受多種因素如土壤水分、光照、溫度、植物本身的生理狀況等綜合因素的影響。本試驗是在其他影響基本一致的條件下，研究了氮素水平與葉片光合速率、葉片葉綠素總含量、NRA以及NiRA的關系。

硝態(tài)氮對于葉綠素總含量、硝酸還原酶活性(NRA)、亞硝酸還原酶活性(NiRA)皆有促進作用。本試驗中葉綠素總含量在N0到N120水平內，葉綠素總含量隨施氮量的增加而提高，但是N180處理下葉綠素總含量與N120處理時基本一致，這與曲文章等［20］的研究結果有一定區(qū)別，可能是由于品種差異，葉綠素總含量在氮素水平120 kg/hm2已經達到單位鮮重的最大量。而兩種酶的活性則是隨著氮水平的增加而升高，表現為 N180＞N120＞N60＞N0。NR活性隨著硝態(tài)氮水平的增加而提高，這與前人在甜菜［6］及小麥［21］中的研究相一致。試驗結果可以看出，葉中NiR活性高峰滯后NR活性一個時期，這與氮代謝的過程一致，首先，硝態(tài)氮被硝酸還原酶還原成亞硝態(tài)氮，然后亞硝態(tài)氮激活亞硝酸還原酶或刺激亞硝酸還原酶表達，將亞硝態(tài)氮還原成銨。

甜菜光合速率在N120和N180處理下變化較小，此結果與于海彬［22］的研究一致?？赡苁翘鸩说墓夂纤俾手饕獩Q定因素在于品種，品種決定了其最大極限，氮素調控只能使作物盡可能發(fā)揮出潛力;或者是試驗過程中的光強度不足導致光合受限。光合速率變化趨勢與葉綠素及酶活性的變化趨勢有差異，可能是植株光合產生的還原力遠遠大于單一酶代謝所需，正因此才有富余能量進行干物質積累，因此光合速率的起伏對酶活性沒有明顯影響;也可能是本試驗中用光合速率代表光合能力做光合與NR、NiR活性關系相關研究不是很適合，試驗中所用測定方法是以單位時間、單位葉面積CO2的吸收量間接表示光合能力，但是酶活性的主要相關因素是還原力，光合反應中生成的還原力如何分配，有多少提供給NR、NiR進行氮代謝并不清楚。因此，可以用葉綠素熒光測定儀測定光反應階段的光合情況，進一步研究光合與NR和NiR的關系。

將葉綠素總含量的動態(tài)規(guī)律與NR活性的動態(tài)規(guī)律進行比較發(fā)現，兩者皆為雙峰曲線，但是葉綠素的含量高峰早于NR活性高峰，可能是因為NR需要葉綠素進行光合產生還原力，所以葉綠素以及光合系統(tǒng)的建成高峰先于氮素同化的高峰。葉綠素與酶活性的相關性分析雖然呈現正相關，但顯著或極顯著時期較少，可能是由于NR和NiR雖然需要光合提供還原力，但是光合速率的影響因素較多，而且還要考慮呼吸消耗以及其他的能量轉化。葉片NiR活性與葉綠素的相關性較好，可能是由于NiR的還原力是Fd，而Fd直接產生于光反應，兩者之間的反應過程直接相連。

4 結論

光合速率呈單峰曲線變化，NR、NiR活性及葉綠素總含量基本呈雙峰曲線變化。不同施氮量對甜菜光合速率、葉綠素總含量、硝酸還原酶及亞硝酸還原酶活性的影響不同。氮肥施用量在120 kg/hm2時顯著提高了甜菜光合速率、葉綠素總含量、NR和NiR活性。與氮肥施用量為120 kg/hm2相比，在180 kg/hm2時光合速率及葉綠素總含量沒有明顯變化，NR和NiR活性則有一定的提高。葉綠素總含量與NR和NiR活性在生育中后期表現為顯著或極顯著正相關關系。本試驗條件下，施氮量為180 kg/hm2時獲得甜菜產量的最高值63.94 t/hm2，不施氮時獲得含糖率的最高值17.01%，施氮量120 kg/hm2時獲得產糖量的最高值9567.94 kg/hm2。

［1］潘瑞熾.植物生理學(第五版)［M］.北京:高等教育出版社，2004.45－48.Pan R C.Plant physiology(5th Edn.)［M］.Beijing:Higher Education Press，2004.45－48.

［2］田華，段美洋，王蘭.植物硝酸還原酶功能的研究進展［J］.中國農學通報，2009，25(10):96－99.Tian H，Duan M Y，Wang L.Research progress on nitrate reductase functions in plants［J］.Chin.Agric.Sci.Bull.，2009，25(10):96－99.

［3］洪華生，王玉玨，王大志.海洋浮游植物硝酸還原酶研究進展［J］.海洋科學，2007，31(10):4－10.Hong H S，Wang Y Y，Wang D Z.Study on process of nitrate reductase(NR)in marine phyton-plankton［J］.Mar.Sci.，2007，31(10):4－10.

［4］May S K，顧立江，程紅梅.植物中硝酸還原酶和亞硝酸還原酶的作用［J］.生物技術進展，2011，1(3):159－164.May S K，Gu L J，Cheng H M.The role of nitrate reductase and nitrite reductase in plant［J］.Cur.Biotechnol.，2011，1(3):159－164.

［5］陳志英.甜菜氮素同化與蔗糖代謝機理研究及人工調控［D］.哈爾濱:東北農業(yè)大學博士學位論文，2008.Chen Z Y.Study on the mechanism and regulation of nitrogen assimilation and sucrose metabolism of sugar beet［D］.Harbin:PhD dissertation，Northeast Agricultural University，2008.

［6］李彩鳳，馬鳳鳴，趙越，李文華.氮素形態(tài)對甜菜氮糖代謝關鍵酶活性及相關產物的影響［J］.作物學報，2003，29(1):128－132.Li C F，Ma F M，Zhao Y，Li W X.Effects of nitrogen forms on key enzyme activities and related products in sugar and nitrogen metabolism of sugar beet(Beta vulgaris L.)［J］.Acta Agron.Sin.，2003，29(1):128－132.

［7］劉淑云，董樹亭，趙秉強，等.長期施肥對夏玉米葉片氮代謝關鍵酶活性的影響［J］.作物學報，2007，33(2):278－283.Liu S Y，Dong S T，Zhao B Q et al.Effects of long-term fertilization on activities of key enzymes related to nitrogen metabolism(ENM)of maize leaf［J］.Acta Agron.Sin.，2007，33(2):278－283.

［8］張杰，屈紅軍，任靜，等.甜菜硝酸還原酶全長基因的克隆及其在缺氮脅迫下表達與活性分析［J］.黑龍江大學自然科學學報，2008，25(5):614－620.Zhang J，Qu H J，Ren J et al.Cloning of full-length gene of nitrate reductase and analysis on mRNA expression activity under N-absent stress condition in sugar beet(Beta vulgaris L.)［J］.J.Nat.Sci.Heilongjiang Univ.，2008，25(5):614－620.

［9］越鵬.甜菜葉片衰老超微結構變化及氮對光合特性調控與Rubisco抗體制備［D］.哈爾濱:東北農業(yè)大學碩士學位論文，2010.Yue P.Change of ultrastructure and nitrogen regulation on photosynthesisofsugarbeetleaves (Beta Vulgaris L.)senescence， rubisco antibody preparation［D］. Harbin:Ms thesis，Northeast Agricultural University，2010.

［10］陳龍正，梁亮，徐海，等.小白菜光合性能與硝酸還原酶活性關系的研究［J］.西北植物學報，2009，29(11):2256－2260.Chen Z L，Liang L，Xu H et al.Relationship of photosynthetic characters and nitrate reductase activity of pakchoi［J］.Acta Bot.Bor.－Occid.Sin.，2009，29(11):2256－2260.

［11］劉燕.黃瓜嫁接苗對NO－3脅迫的生理響應［D］.泰安:山東農業(yè)大學碩士學位論文，2010.Liu Y.The physiological response of cucumber grafted seedlings tostress［D］.Tai’an:Ms thesis，Shandong Agricultural University，2010.

［12］郝再彬，蒼晶，徐仲.植物生理實驗［M］.哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學出版社，2004.46－49.Hao Z B，Cang J，Xu Z.Plant physiology experiments［M］.Harbin:Harbin Institute of Technology Press，2004.46－49.

［13］于海彬，蔡葆，孫國琴，等.甜菜硝酸還原酶活性研究［J］.中國甜菜，1993，(3):18－23.Yu H B，Cai B，Sun G Q et al.Studies on nitrate reductase activity in sugar beet［J］.Chin.Sug.Beet，1993，(3):18－23.

［14］Rajasekhar V K，Mohr H.Appearance of nitrite reductase in cotyledons of the mustard(Sinapis alba L.)seedling as affected by nitrate，phytochrome and photooxidative damage of plastids［J］.Planta，1986，168:369－376.

［15］Ozawa K，Kawahigashi H.Positional cloning of the nitrite reductase gene associated with good growth and regeneration ability of calli and establishment of a new selection system for Agrobacterium mediated transformation in rice(Oryza sativa L.)［J］.Plant Sci.，2006，170:384－393.

［16］邵金旺，蔡葆，張家驊.甜菜生理學［M］.北京:農業(yè)出版社，1991.181－196.Shao J W，Cai B，Zhang J H.Sugar beet physiology［M］.Beijing:Agriculture Press，1991.181－196.

［17］李文華.氮素水平和形態(tài)對甜菜(Beta Vulgaris L.)形態(tài)建成和氮素同化的影響［D］.哈爾濱:東北農業(yè)大學博士學位論文，2002.Li W H.The effete of nitrogen levels and form on nitrogen assimilation and morphogenesis of sugar beet(Beta Vulgaris L.)［D］.Harbin: PhD dissertation， Northeast Agricultural University，2002.

［18］馬鳳鳴，高繼國.硝酸還原酶活力作為甜菜氮素營養(yǎng)診斷及預測產糖量指標的研究［J］.中國農業(yè)科學，1996，29(5):16－22.Ma F M，Gao J G.Studies on nitrate reductase activity as indices of nitrogen nutrition diagnosis and sugar yield prediction in sugar beet［J］.Sci.Agric.Sin.，1996，29(5):16－22.

［19］黃兆峰.氮素水平對甜菜葉片衰老調控的研究［D］.哈爾濱:東北農業(yè)大學碩士學位論文，2009.Huang Z F.Study on regulating leaves senescence with nitrogen levels in sugar beet(Beta Vulgaris L.)［D］.Harbin:Ms thesis，Northeast Agricultural University，2009.

［20］曲文章，蔡伯巖，高妙真.氮素水平對甜菜光合效率的影響［J］.中國甜菜糖業(yè)，1999，(4):1－4.Qu W Z，Cai B Y，Gao M Z.The affection of nitrogen amount to photosynthetic efficient in the sugar beet plant［J］.Chin.Beet Sug.，1999，(4):1－4.

［21］肖凱，張淑華，鄒定輝.不同形態(tài)氮素營養(yǎng)對小麥光合特性的影響［J］.作物學報，2000，26(1):53－58.Xiao K，Zhang S H，Zou D H.The effect of different nitrogen nutrition forms photosynthetic characteristics in wheat leaves［J］.Acta Agron.Sin.，2000，26(1):53－58.

［22］于海彬，周芹，劉娜，等.不同氮磷營養(yǎng)水平對甜菜葉片光合速率的影響［J］.中國糖料，2001，(3):19－21.Yu H B，Zhou Q，Liu N et al.Effect on the photosynthetic rate of sugar beet blade with different level of N，P applied［J］.Sug.Crops Chin.，2001，(3):19－21.