NaCl脅迫對(duì)菜用大豆種子膨大初期蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

王 聰，朱月林，楊立飛，楊恒山

(1內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028042;2國家大豆改良中心，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京210095)

Ramani和 Apte［2］用放射性同位素自顯影雙向電泳法研究水稻幼苗在鹽脅迫下多基因的瞬時(shí)表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，至少有35個(gè)蛋白質(zhì)被鹽脅迫誘導(dǎo)，17個(gè)蛋白質(zhì)被抑制，其中包括20個(gè)在這之前未曾報(bào)道的低豐度蛋白。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)尋找滲透應(yīng)答新基因，尤其是那些在水稻鹽耐性獲得中起瞬時(shí)調(diào)節(jié)作用的基因十分重要。Majoul等［3］用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)熱脅迫下六倍體小麥蛋白質(zhì)表達(dá)的變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)有24個(gè)上調(diào)蛋白，19個(gè)下調(diào)蛋白。將這些蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，從中鑒定出42個(gè)蛋白質(zhì)，其中部分為植物代謝途徑中的酶，有5個(gè)上調(diào)蛋白與一些低分子量熱激蛋白存在相似性，有3個(gè)蛋白與延伸因子或真核翻譯起始因子有關(guān)，還有一些蛋白參與了非生物脅迫應(yīng)答或植物防御機(jī)制。周偉輝等［4］的研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫導(dǎo)致水稻葉片中光合作用相關(guān)蛋白以及能量類、代謝類蛋白表達(dá)量下降，同時(shí)，高溫脅迫也誘導(dǎo)產(chǎn)生了一些抗逆蛋白。另外，耐熱品種和敏感品種之間蛋白質(zhì)表達(dá)存在差異。高溫導(dǎo)致Rubisco相關(guān)蛋白表達(dá)量下降，敏感品種的下降程度遠(yuǎn)大于耐熱品種;高溫誘導(dǎo)耐熱品種葉片中PSII放氧復(fù)合蛋白1表達(dá)。能量類蛋白中，ATP合成酶相關(guān)蛋白的表達(dá)在敏感品種中顯著下降，且其鐵氧化蛋白-NADP(H)-氧化還原酶(FNR)表達(dá)量下降。敏感品種磷酸吡哆醛-轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量顯著下降，而耐熱品種表現(xiàn)上升。高溫脅迫誘導(dǎo)耐熱品種葉片中2-cys過氧化物酶(BAS1)表達(dá)量顯著上升。Jagadish等［5］研究了高溫、干旱及高溫+干旱脅迫下水稻小穗蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)有29個(gè)蛋白點(diǎn)的豐度在上述脅迫下變化顯著，其中多數(shù)蛋白點(diǎn)僅對(duì)干旱脅迫敏感，而對(duì)高溫脅迫敏感的蛋白同時(shí)對(duì)干旱脅迫也敏感;干旱脅迫下顯著上調(diào)的蛋白點(diǎn)中，有6個(gè)點(diǎn)的豐度在高溫+干旱條件下恢復(fù)到對(duì)照水平，而高溫脅迫下豐度顯著上調(diào)的2個(gè)蛋白點(diǎn)在高溫+干旱條件下其豐度的上調(diào)幅度大幅增加。

鹽脅迫已成為引起植物產(chǎn)量和品質(zhì)下降的一種主要的非生物脅迫類型。鹽脅迫下，植物體會(huì)在細(xì)胞、分子等不同水平發(fā)生一系列變化，對(duì)脅迫做出響應(yīng)，以降低逆境對(duì)其造成的傷害。蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，植物在生存環(huán)境發(fā)生變化的條件下，其體內(nèi)功能蛋白的表達(dá)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、鑒定、功能分析，即可了解植物體對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)機(jī)制。目前，科研工作者運(yùn)用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)大豆種子蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化及不同基因型大豆種子儲(chǔ)藏蛋白的差異性進(jìn)行了研究［6-8］，但未見有關(guān)鹽脅迫下大豆種子中差異蛋白研究的報(bào)道。我們已就NaCl脅迫對(duì)菜用大豆種子中球蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行了研究［9］，本實(shí)驗(yàn)以菜用大豆為材料，運(yùn)用雙向電泳技術(shù)對(duì)NaCl脅迫下種子膨大初期差異表達(dá)蛋白進(jìn)行研究，以期為菜用大豆生殖生長時(shí)期對(duì)NaCl脅迫的響應(yīng)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試材培育及處理

供試菜用大豆［Glycine max(L.)Merr.］為南京地區(qū)主栽品種“理想高產(chǎn)95-1”。試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行。4月10日干種子直播于上直徑39 cm、下直徑26 cm、高34 cm的塑料盆中，蛭石作基質(zhì)，每盆定苗4株。真葉展開后每2 d澆1/4濃度日本園試營養(yǎng)液1次，每盆澆1 L;開花后澆1/2濃度營養(yǎng)液，澆液量同前期。

5月13日始花。此后一周內(nèi)每天掛牌標(biāo)記開花期，并記錄每天的掛牌數(shù)，以此確定每天的開花數(shù)。5月15日花數(shù)最多，實(shí)驗(yàn)即以該天開花形成的種子為研究對(duì)象。

開花后10 d(5月25日)進(jìn)行NaCl處理。通過NaCl處理濃度篩選實(shí)驗(yàn)［10］確定適宜的NaCl處理濃度為100 mmol/L。NaCl溶于1/2濃度日本園試營養(yǎng)液，均勻澆入基質(zhì)中，每2 d澆液1次，每盆澆1 L。對(duì)照僅澆營養(yǎng)液。每處理5盆，3次重復(fù)，隨機(jī)排列。

5月30日(NaCl處理后5 d)開始取樣，取同一天開花(5月15日)形成的種子。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 菜用大豆未成熟種子中可溶性蛋白質(zhì)的提取將0.5 g未成熟種子在液氮中磨成粉末，用TCA丙酮沉淀法制得蛋白粉［11-12］。每mg蛋白粉中加入10 μL蛋白質(zhì)裂解緩沖液［8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS(w/v)、65 mmol/L DTT、1%兩性電解質(zhì)pH 4～7(v/v)，0.1%蛋白酶抑制劑(w/v)］溶解。4℃攪拌10 min后，100 r/min下?lián)u床搖勻20 min，冰浴超聲波處理 3 min，4℃、35000 r/min離心20 min，取上清液，即得蛋白樣品，用蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定樣品液中蛋白質(zhì)的濃度。

1.2.2 雙向電泳(2-DE)樣品用上樣緩沖液［8 mol/L 尿素，4%CHAPS(w/v)，50 mmol/L DTT，0.5%IPG Buffer pH 4 ～7(v/v)，痕量溴酚藍(lán)］稀釋，每根17 cm pH 4～7線性IPG預(yù)制膠條(為Bio-Rad公司產(chǎn)品)，考染蛋白質(zhì)上樣量為850 μg，總上樣體積為350 μL。水化和聚焦在19℃下自動(dòng)進(jìn)行。50 V電壓下水化12 h后，經(jīng)過250 V 0.5 h、500 V 0.5 h、1000 V 1 h、3000 V 1 h，最后穩(wěn)定在8000 V下聚焦50000 Vh。聚焦完畢后，膠條在平衡液［0.375 mol/L Tris-HCl(pH 8.8)，6 mol/L 尿素，30%甘油，5%SDS(w/v)，2%DTT(w/v)］中平衡15 min，然后進(jìn)行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為12%。

以配變?cè)O(shè)備為核心，從設(shè)備自身、電網(wǎng)環(huán)境、自然環(huán)境等方面系統(tǒng)分析影響配變?cè)O(shè)備運(yùn)行相關(guān)因素，梳理相關(guān)信息來源，涵蓋電力內(nèi)部GIS、PMS、用采、營銷等電力信息系統(tǒng)，以及外部氣象、地理、人口等公開數(shù)據(jù)源，經(jīng)采集、清洗、整合等預(yù)處理過程，構(gòu)建基礎(chǔ)寬表，為進(jìn)一步的特征分析、建模判定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1.2.3 染色、脫色 第二向電泳結(jié)束后，凝膠用雙蒸水漂洗3次后用考馬斯亮藍(lán)染色液［20%甲醇(v/v)、1.6%磷酸(v/v)、8%硫酸銨(w/v)和0.08%考馬斯亮藍(lán)G250(w/v)］染色16 h，然后用脫色液(20% 甲醇、5% 冰醋酸、75% 蒸餾水)脫色，中間更換2～3次脫色液，脫色至背景清晰。

1.2.4 2-DE圖像分析 凝膠經(jīng)Bio-Rad公司VersaDoc 3000凝膠成像系統(tǒng)掃描后用Image Master Platinum 軟 件 (Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)進(jìn)行分析處理，包括背景消減、蛋白質(zhì)點(diǎn)檢測(cè)、分子量和等電點(diǎn)計(jì)算等［9，13］，同時(shí)為了定量各蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)水平，較準(zhǔn)確地反映各點(diǎn)量的變化，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用該軟件對(duì)各點(diǎn)相對(duì)體積進(jìn)行了分析［6］。相對(duì)體積即單個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的體積占膠內(nèi)所有點(diǎn)總體積的百分?jǐn)?shù)。用相對(duì)體積代替體積進(jìn)行定量分析，便于不同膠內(nèi)蛋白質(zhì)點(diǎn)的比較分析。待測(cè)樣品的雙向電泳分析和凝膠圖譜分析重復(fù)3次。

1.2.5 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定 將脫色后凝膠上的目標(biāo)蛋白質(zhì)點(diǎn)切下送中科院上海生命科學(xué)研究院蛋白質(zhì)組研究分析中心進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。使用德國Bruker公司產(chǎn)BIFLEX III型MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，氮激光器，激光波長337 nm。離子源加速電壓為20 kV，反射電壓為23 kV，正離子反射檢測(cè)，以基質(zhì)峰、酶自動(dòng)降解片段峰進(jìn)行校正，去除角蛋白峰和胰酶自切峰，精確標(biāo)定強(qiáng)度為基質(zhì)峰強(qiáng)度2倍以上的峰，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜［13］。

用 MASCOT(http://www.matrixscience.com)軟件在NCBInr蛋白庫中對(duì)獲得的肽片段數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，物種為Green plant。為確保蛋白質(zhì)鑒定的可靠性，每個(gè)被鑒定的蛋白序列覆蓋率至少達(dá)15%以上，理論分子量、等電點(diǎn)(theoretical Mr/I)與2-DE圖譜所獲的分子量、等電點(diǎn)(experimental Mr/I)值相差不超過25%;最大未水解酶切位點(diǎn)數(shù)(max missed cleavages)，選擇1;固定修飾，選擇 Carbamidomethyl(C);可變修飾，選擇Oxidation(M);可接受的肽段分子量誤差為0.3 Da。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，采用t測(cè)驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫下菜用大豆種子蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜分析

研究表明，大豆種子發(fā)育過程中蛋白質(zhì)點(diǎn)主要分布在pH 4～7的范圍［6］，為了得到分離效果較好的蛋白質(zhì)圖譜，本研究采用pH 4～7的線性IPG膠條對(duì)菜用大豆種子蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，得到了重復(fù)性好的2-DE圖譜(圖1)。用Image Master Platinum軟件對(duì)圖譜進(jìn)行檢測(cè)，在分子量14.4～94.0 kD，等電點(diǎn)4～7范圍內(nèi)，對(duì)照和處理的2-DE圖譜上均檢測(cè)到327個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。

用Image Master Platinum軟件對(duì)兩2-DE圖譜進(jìn)行匹配分析，并計(jì)算各蛋白點(diǎn)的相對(duì)體積，以此來表示各蛋白的豐度。結(jié)果顯示，對(duì)照與NaCl處理的2-DE圖譜之間存在3次重復(fù)一致出現(xiàn)的28個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中16個(gè)蛋白顯著上調(diào)，另外12個(gè)顯著下調(diào)(圖1)。對(duì)照及處理2-DE圖譜中各上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白的相對(duì)體積(蛋白質(zhì)豐度)見表1。

2.2 部分差異表達(dá)蛋白的基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜分析

圖1 NaCl脅迫下菜用大種子膨大初期蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜Fig.1 Two-dimensional gel electrophoresis(2 －DE)maps of vegetable soybean seed proteins at the early filling stage under the NaCl stress

表1 NaCl脅迫下28個(gè)差異表達(dá)蛋白的豐度變化Table 1 Changes in abundances of 28 differentially expressed proteins

從28個(gè)差異表達(dá)蛋白中選取6個(gè)豐度變化較大的點(diǎn)1、2、7、16、25及26(豐度變化在2.5倍以上)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)分析，從中鑒定出5個(gè)蛋白，分別是點(diǎn)2、7、16、25及26(表2)。

表2 差異表達(dá)蛋白的肽質(zhì)量指紋圖譜數(shù)據(jù)庫檢索鑒定結(jié)果Table 2 Differentially expressed proteins identified by peptide mass finger printing map(PMF)query

圖2為蛋白點(diǎn)7的肽質(zhì)量指紋圖譜，圖中用黑體數(shù)字標(biāo)注的12條肽段為蛋白點(diǎn)7與肌動(dòng)蛋白(actin)匹配到的肽段;圖3為actin的氨基酸序列，圖中粗體劃線的12條肽段是蛋白點(diǎn)7與actin相匹配的肽段及相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，序列覆蓋率達(dá)36%。

圖2 蛋白點(diǎn)7的肽質(zhì)量指紋圖譜Fig.2 Peptide mass fingerprinting map of protein spot 7

圖3 Actin的氨基酸序列Fig.3 The amino acid sequence of actin

3 討論

種子發(fā)育可分為胚胎形成、種子膨大和成熟三個(gè)階段，其中種子膨大是種子發(fā)育過程中持續(xù)時(shí)間最長的階段，該階段主要進(jìn)行細(xì)胞分裂、膨大及儲(chǔ)藏物質(zhì)合成等生理活動(dòng)。對(duì)大豆而言，花后2～6周屬種子膨大期［14］，此期的代謝活動(dòng)對(duì)種子儲(chǔ)藏物質(zhì)積累及種子品質(zhì)的優(yōu)劣具有至關(guān)重要的作用［15］。種子膨大初期(花后2～3周)主要進(jìn)行細(xì)胞分裂，儲(chǔ)藏物質(zhì)的合成是在細(xì)胞分裂完成之后進(jìn)行，種子的生長則是通過細(xì)胞膨大及儲(chǔ)藏物質(zhì)的積累來實(shí)現(xiàn)［16］。蛋白質(zhì)代謝與種子的生命活動(dòng)是密切相關(guān)的，且其代謝是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程，在種子發(fā)育的不同階段會(huì)合成類型數(shù)量不同的蛋白質(zhì)。Hajduch等［6］的研究發(fā)現(xiàn)，大豆種子膨大過程中，代謝類蛋白(如各種代謝酶)、與細(xì)胞生長、分裂相關(guān)蛋白(如微管蛋白，肌動(dòng)蛋白等)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)量在種子膨大的前期較高，隨著種子的發(fā)育其表達(dá)量逐漸降低，而儲(chǔ)藏蛋白的表達(dá)量隨著種子的發(fā)育逐漸增加。這些動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)構(gòu)成了細(xì)胞某一時(shí)刻的特征性生命活動(dòng)基礎(chǔ)，對(duì)其進(jìn)行研究是認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)本質(zhì)的一個(gè)恰當(dāng)而直接的途徑［17］。

NaCl脅迫所引起的滲透脅迫、離子毒害以及次生的氧化脅迫會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害，引起細(xì)胞代謝紊亂［18］，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的代謝和積累。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)NaCl脅迫后某一時(shí)期的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行研究，即可獲得NaCl脅迫下該時(shí)期蛋白質(zhì)代謝變化的信息，進(jìn)而揭示NaCl脅迫對(duì)該時(shí)期生命活動(dòng)的影響。本研究結(jié)果顯示，NaCl脅迫5 d(花后15 d)后，對(duì)照與處理的2-DE圖譜之間出現(xiàn)了28個(gè)差異表達(dá)蛋白，這充分說明了NaCl脅迫對(duì)菜用大豆種子膨大初期的蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生了顯著影響。

球蛋白是大豆的主要儲(chǔ)藏蛋白，其主要組分有7S球蛋白和11S球蛋白，兩者占儲(chǔ)藏蛋白的75%左右［19］。11S球蛋白又稱大豆球蛋白，由6個(gè)亞基組成［20］。研究表明，大豆球蛋白由5個(gè)非等位基因Gy1、Gy2、Gy3、Gy4和Gy5分別編碼形成5個(gè)大豆球蛋白前體分子 G1、G2、G3、G4 和 G5［19，21］。本研究表明，NaCl脅迫2-DE圖譜中大豆球蛋白前體G2(protein spot 2)及大豆球蛋白前體G2相似蛋白(protein spot 16)均顯著下調(diào)。說明NaCl脅迫對(duì)菜用大豆種子中11S儲(chǔ)藏蛋白及相似蛋白的積累產(chǎn)生了顯著的抑制作用。

肌動(dòng)蛋白是組成微絲的結(jié)構(gòu)蛋白。兩條線性排列的肌動(dòng)蛋白鏈形成的螺旋構(gòu)成微絲，狀如雙線捻成的繩子。微絲是細(xì)胞骨架的重要成分，在植物生長發(fā)育過程中具有許多重要的生理功能，如維持細(xì)胞形態(tài)和確定胞內(nèi)區(qū)隔;細(xì)胞的收縮、運(yùn)動(dòng)等。此外，微絲還具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。大量研究表明，微絲與來自于質(zhì)膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)放大密切相關(guān)［22-27］。滲透脅迫下，植物細(xì)胞發(fā)生了一系列生理變化，如胞液Ca2+濃度發(fā)生改變［28-29］;促分裂原活化蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活［30］;肌醇信號(hào)系統(tǒng)中多磷酸肌醇的快速合成［31-32］。以上這些生理變化都與肌動(dòng)蛋白微絲的調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)［33-34］。肌動(dòng)蛋白微絲是真核細(xì)胞胞外信號(hào)的靶標(biāo)和綜合者，其結(jié)構(gòu)的改變很可能是對(duì)生物和非生物脅迫信號(hào)的一個(gè)應(yīng)答反應(yīng)［35］。研究表明，質(zhì)壁分離引起細(xì)胞Ca2+濃度迅速升高，由此直接導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白亞基聚合親和力增加［36］或間接地通過一系列Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來影響肌動(dòng)蛋白活動(dòng)［37-38］。Komis等研究發(fā)現(xiàn)［39］，滲透脅迫下，與對(duì)照相比，吊籃葉肉質(zhì)壁分離細(xì)胞中膜下肌動(dòng)蛋白微絲含量顯著增加，同時(shí)肌動(dòng)蛋白微絲發(fā)生了聚合重組，認(rèn)為肌動(dòng)蛋白網(wǎng)狀組織迅速重組對(duì)逆境脅迫下植物組織細(xì)胞信號(hào)感知是非常重要的。Galbraith等［40］的研究表明，動(dòng)物沿血管排列的內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)不斷地受到來自血液的剪切應(yīng)力，為了抵消這種應(yīng)力，這些內(nèi)皮細(xì)胞形成了龐大的皮層肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維。吊籃葉肉質(zhì)壁分離細(xì)胞質(zhì)膜下形成大量肌動(dòng)蛋白網(wǎng)很可能是為了抵消質(zhì)膜受到來自質(zhì)壁分離引起的剪切應(yīng)力，這可能與動(dòng)物細(xì)胞形成肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的機(jī)制相同［39］。同時(shí)，肌動(dòng)蛋白微絲重組可阻止“凸形”原生質(zhì)體出現(xiàn)，維持質(zhì)膜的穩(wěn)定性，進(jìn)而維持細(xì)胞的正常形態(tài)［39］。此外，肌動(dòng)蛋白重組還可能控制質(zhì)膜離子通道和水通道調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞滲透平衡，進(jìn)而維持原生質(zhì)體體積［39］。本研究中，菜用大豆種子肌動(dòng)蛋白(protein spot 7)的豐度在NaCl脅迫下顯著增加，說明NaCl脅迫對(duì)肌動(dòng)蛋白的表達(dá)產(chǎn)生了顯著的誘導(dǎo)作用。這與吊籃葉肉細(xì)胞在滲透脅迫下的反應(yīng)相同。NaCl脅迫可導(dǎo)致植物細(xì)胞發(fā)生一系列的生理變化，如質(zhì)壁分離、膜脂過氧化等，同時(shí)可導(dǎo)致Ca2+濃度迅速升高，而Ca2+濃度的升高可能直接或間接誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白微絲聚合重組［36-38］，進(jìn)而引起肌動(dòng)蛋白大量合成。而肌動(dòng)蛋白微絲聚合重組在對(duì)胞外信號(hào)感知、維持細(xì)胞正常形態(tài)及質(zhì)膜穩(wěn)定性、維持細(xì)胞滲透平衡等方面發(fā)揮著重要作用。肌動(dòng)蛋白是肌動(dòng)蛋白微絲聚合重組的物質(zhì)基礎(chǔ)，NaCl脅迫下肌動(dòng)蛋白表達(dá)量增加可能是菜用大豆種子細(xì)胞阻止或緩解鹽脅迫傷害的一種應(yīng)激反應(yīng)。

Valkov和 Ivanov［41］研究發(fā)現(xiàn)，豌豆葉綠體中的纖維狀骨架結(jié)構(gòu)由類微管蛋白組成。Margolin［42］認(rèn)為類微管蛋白FtsZ在植物葉綠體和部分線粒體分裂過程中發(fā)揮著重要作用。而有關(guān)植物體中類α-微管蛋白的生理功能還未見報(bào)道。本研究中NaCl脅迫下類α-微管蛋白(protein spot 25)的表達(dá)量顯著增加，推測(cè)該蛋白也可能與種子細(xì)胞器(葉綠體和線粒體)的分裂有關(guān)。種子膨大初期的主要生理活動(dòng)是細(xì)胞分裂、增殖，NaCl脅迫下細(xì)胞通過大量合成類α-微管蛋白來維持細(xì)胞器乃至細(xì)胞分裂、增殖的順利進(jìn)行，進(jìn)而降低NaCl脅迫對(duì)種子膨大造成的不利影響。

蛋白酶抑制劑在植物、動(dòng)物及微生物體中普遍存在，在調(diào)節(jié)內(nèi)源酶活性、抵抗害蟲及病源微生物入侵中發(fā)揮著重要作用［43］。蛋白酶抑制劑可分為48個(gè)家族［44］，其中Kunitz型蛋白酶抑制劑屬典型絲氨酸蛋白酶抑制劑，廣泛存在于植物體中。大豆中胰蛋白酶抑制劑約有7～10種［45］，其中Kunitz型胰蛋白酶抑制劑在大豆中含量最豐富。通常認(rèn)為Kunitz型胰蛋白酶抑制劑具有調(diào)節(jié)內(nèi)源蛋白酶活性和植物防御等作用，是植物自身保護(hù)系統(tǒng)的重要組成部分。研究表明，植物體內(nèi)胰蛋白酶抑制劑可與蛋白水解酶結(jié)合，使酶以無活性的形式存在，酶受到激活后，中和掉抑制劑從而表現(xiàn)出逐漸增強(qiáng)的酶活力［46-48］。說明胰蛋白酶抑制劑能與相應(yīng)的蛋白水解酶形成一定的動(dòng)態(tài)平衡，防止自身蛋白質(zhì)發(fā)生分解代謝。Ledoigt等［49］研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯塊莖在水分脅迫下積累大量Kunitz型胰蛋白酶抑制劑，認(rèn)為該抑制劑與其它多肽密切相關(guān)，通過保護(hù)其它多肽免受胰蛋白類蛋白酶分解而行使植物保護(hù)功能。本研究結(jié)果顯示，NaCl脅迫下菜用大豆種子中Kunitz型胰蛋白酶抑制劑(protein spot 26)的表達(dá)量顯著增加。這與水分脅迫下馬鈴薯塊莖的表現(xiàn)相同。說明非生物逆境脅迫可對(duì)Kunitz型胰蛋白酶抑制劑表達(dá)產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。NaCl脅迫可導(dǎo)致膜脂過氧化，打破蛋白質(zhì)的代謝平衡，加速蛋白質(zhì)分解、破壞［50-51］，而胰蛋白酶抑制劑大量表達(dá)，可有效抑制蛋白酶的水解活力，降低蛋白質(zhì)的分解速度，同時(shí)還可保護(hù)其它防御蛋白不被降解，提高細(xì)胞的防御能力。NaCl脅迫下Kunitz型胰蛋白酶抑制劑表達(dá)量增加可能是菜用大豆種子對(duì)NaCl脅迫的一種應(yīng)答反應(yīng)。

4 結(jié)論

NaCl脅迫對(duì)菜用大豆種子膨大初期的蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生了顯著影響。NaCl脅迫下種子細(xì)胞通過大量合成肌動(dòng)蛋白來確保信號(hào)感知、維持細(xì)胞原生質(zhì)正常形態(tài)及滲透平衡等功能的順利實(shí)現(xiàn);通過大量合成Kunitz型胰蛋白酶抑制劑來抑制蛋白質(zhì)的分解，同時(shí)提高細(xì)胞的防御能力，進(jìn)而降低NaCl脅迫對(duì)細(xì)胞造成的傷害，這可能是其對(duì)NaCl脅迫的一種應(yīng)答反應(yīng)。

［1］Drewes G，Bouwmeester T，Cellzome A G.Global approaches to protein-protein interactions［J］.Curr.Opin.Cell Biol.，2003，15(2):199-205.

［2］Ramani S，Apte S K.Transient expression of multiple genes in salinity-stressed young seedlings of rice(Oryza sativa L.)cv.Bura Rata［J］.Biochem.Biophys.Res.Commun.，1997，233(3):663-667.

［3］Majoul T，Bancel E，Tribo? E et al.Proteomic analysis of the effect of heat stress on hexaploid wheat grain:characterization of heat-responsive proteins from non-prolamins fraction［J］.Proteomics，2004，4(2):505-513.

［4］周偉輝，薛大偉，張國平.高溫脅迫下水稻葉片的蛋白響應(yīng)及其基因型和生育期差異［J］.作物學(xué)報(bào)，2011，37(5):820-831.Zhou W H，Xue D W，Zhang G P.Protein response of rice leaves to high temperature stress and its difference of genotypes at different growth stage［J］.Acta Agron.Sin.，2011，37(5):820-831.

［5］Jagadish S V K，Muthurajan R，Rang Z W et al.Spikelet proteomic response to combined water deficit and heat stress in rice(Oryza sativa cv.N22)［J］.Rice，2011，4(1):1-11.

［6］Hajduch M，Ganapathy A，Stein J W et al.A systematic proteomic study of seed filling in soybean.Establishment of high-resolution two-dimensional reference maps，expression profiles，and an interactive proteome database［J］.Plant Physiol.，2005，137(4):1397-1419.

［7］Zarkadas C G，Gagnon C，Gleddie S et al.Assessment of the protein quality of fourteen soybean(Glycine max L.Merr.)cultivars using amino acid analysis and two-dimensional electrophoresis［J］.Food Res.Int.，2007，40(1):129-146.

［8］Natarajan S，Xu C，Bae H et al.Proteomic and genetic analysis of glycinin subunits of sixteen soybean genotypes［J］.Plant Physiol.Biochem.，2007，45(6-7):436-444.

［9］王聰，朱月林，楊立飛，等.NaCl脅迫對(duì)菜用大豆種子球蛋白表達(dá)的影響［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2008，28(11):2145-2153.Wang C，Zhu Y L，Yang L F et al.Expression levels of globulins in vegetable soybean seeds under NaCl stress［J］.Acta Bot.Bor-Occid.Sin.，2008，28(11):2145-2153.

［10］王聰，朱月林，楊立飛，等.菜用大豆耐鹽品種的篩選及其耐鹽生理特性［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25(3):621-627.Wang C，Zhu Y L，Yang L F et al.Screening of vegetable soybean cultivars for salt tolerance and their physiological characteristics［J］.Jiangsu J.Agric.Sci.，2009，25(3):621-627.

［11］Gallardo K，Job C，Groot S P C et al.Proteomic analysis of Arabidopsis seed germination and priming［J］.Plant Physiol.，2001，126(2):835-848.

［12］鄭蕊，喻德躍.適于蛋白質(zhì)組研究的大豆種子蛋白雙向電泳技術(shù)的改進(jìn)［J］.大豆科學(xué)，2005，25(3):165-170.Zheng R， Yu D Y. Improvement of two-dimensional electrophoresis of bean seed protein for proteome analysis［J］.Soybean Sci.，2005，25(3):165-170.

［13］Yang L F，Zhu Y L，Hu C M et al.Separation and identification of specific proteins in leaves of grafted cucumber under NaCl stress［J］.Acta Hortic.，2008，771:183-190.

［14］Meinke D W，Chen J，Beachy R N.Expression of storage-protein genes during soybean seed development［J］.Planta，1981，153(2):130-139.

［15］Thelen J J，Ohlrogge J B.Metabolic engineering of fatty acid biosynthesis in plants［J］.Metab.Eng.，2002，4(1):12-21.

［16］Herman E M，Larkins B A.Protein storage bodies and vacuoles［J］.Plant Cell，1999，11(4):601-614.

［17］何大澄，肖雪媛.差異蛋白質(zhì)組學(xué)及其應(yīng)用［J］.北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002，38(4):558-562.He D C，Xiao X Y.Differential proteomics and its applications［J］.J.Beijing Norm.Univ.(Nat.Sci.)，2002，38(4):558-562.

［18］潘瑞熾，董愚得.植物生理學(xué)［M］.北京:高等教育出版社，1995.318-335.Pan R Z，Dong Y D.Plant physiology［M］.Beijing:Higher Education Press，1995.318-335.

［19］Nielsen N C，Dickinson C D，Cho T J et al.Characterization of the glycinin gene family in soybean［J］.Plant Cell，1989，1(3):313-328.

［20］Staswick P E，Hermodson M A，Nielsen N C.Identification of the cystines which link the acidic and basic components of the glycinin subunits［J］.J.Biol.Chem.，1984，259(21):13431-13435.

［21］Renkema J M S，Knabben J H M，van Vliet T.Gel formation by beta-conglycinin and glycinin and their mixtures［J］.Food Hydrocolloids，2001，15(4-6):407-414.

［22］Meagher R B，Mckinney E C，Kandasamy M K.Isovariant dynamics expand and buffer the responses of complex systems:the diverse plant actin gene family［J］.Plant Cell，1999，11(6):995-1006.

［23］Volkmann D，Balu?ka F.Actin cytoskeleton in plants:from transport networks to signaling networks［J］.Microsc.Res.Tech.，1999，47(2):135-154.

［24］Staiger C J.Signaling to the actin cytoskeleton in plants［J］.Annu.Rev.Plant Physiol.Mol.Biol.，2000，51:257-288.

［25］Mccurdy D W，Kovar D R，Staiger C J.Actin and actin-binding proteins in higher plants［J］.Protoplasma，2001，215(1-4):89-104.

［26］Hussey P J，Allwood E G，Smertenko A P.Actin-binding proteins in the Arabidopsis genome database:properties of functionally distinct plant actin-depolymerizing factors/cofilins［J］.Philos.Trans.R.Soc.Lond B Biol.Sci.，2002，357(1422):791-798.

［27］?amaj J，Ovecka M，Hlavacka A et al.Involvement of the mito-gen-activated protein kinase SIMK in regulation of root hair tip growth［J］.EMBO J.，2002，21(13):3296-3306.

［28］Brownlee C，Goddard H，Hetherington A M et al.Specificity and integration of responses:Ca2+as a signal in polarity and osmotic regulation［J］.J.Exp.Bot.，1999，50(Spec.Iss.):1001-1011.

［29］Knight H.Calcium signaling during abiotic stress in plants［J］.Int.Rev.Cytol.，2000，195:269-324.

［30］Jonak C，Ligterink W，Hirt H.MAP kinases in plant signal transduction［J］.Cels.Cell.Mol.Life Sci.，1999，55(2):204-213.

［31］Munnik T，Meijer H J G，ter Riet B et al.Hyperosmotic stress stimulates phospholipase D activity and elevates the levels of phosphatidic acid and diacylglycerol pyrophosphate［J］.Plant J.，2000，22(2):147-154.

［32］Meijer H J G，Arisz S A，van Himbergen J A J et al.Hyperosmotic stress rapidly generates lyso-phosphatidic acid in Chlamydomonas［J］.Plant J.，2001，25(5):541-548.

［33］Richelme F，Benoliel A M，Bongrand P.Dynamic study of cell mechanical and structural responses to rapid changes of calcium level［J］.Cell Motil.Cytoskeleton，2000，45(2):93-105.

［34］Sullivan R，Burnham M，T?r?k K et al.Calmodulin regulates the disassembly of cortical F-actin in mast cells but is not required for secretion［J］.Cell Calcium，2000，28(1):33-46.

［35］Poulter N S，Staiger C J，Rappoport J Z et al.Actin-binding proteins implicated in formation of the punctate actin foci stimulated by the self-incompatibility response in papaver［J］.Plant Physiol.，2010，152:1274-1283

［36］Strzelecka-Golaszewska H.Divalent cations nucleotides，and actin structure［J］.Results Probl.Cell Differ.，2001，32:23-41.

［37］Janmey P A.Phosphoinositides and calcium as regulators of cellular actin［J］.Annu.Rev.Physiol.，1994，56:169-191.

［38］Janmey P A.The cytoskeleton and cell signaling:component localization and mechanical coupling［J］.Physiol.Rev.，1998，78:763-781.

［39］Komis G，Apostolakos P，Galatis B.Hyperosmotic stress-induced actin filament reorganization in leaf cells of Chlorophyton comosum［J］.J.Exp.Bot.，2002，53(375):1699-1710.

［40］Galbraith C G，Skalak R，Chien S.Shear stress induces spatial reorganization of the endothelial cell cytoskeleton［J］.Cell Motil.Cytoskeleton，1998，317-330.

［41］Valkov N，Ivanov A G.Immunogold-localization of tubulin-like protein in the intra-skeletal structure of pea chloroplasts［J］.NATO ASI Ser.:Ser.A:Life Sci.，1992，226:463-468.

［42］Margolin W.FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles［J］.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，2005，6(11):862-871.

［43］Habib H，F(xiàn)azili K M.Plant protease inhibitors:a defense strategy in plants［J］.Biotechnol.Mol.Biol.Rev.，2007，2(3):068-085.

［44］Rawlings N D，Tolle D P，Barrett A J.Evolutionary families of peptidase inhibitors［J］.J.Biochem.，2004，378:705-716.

［45］Bode W，Huber R.Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinaes［J］.Eur.J.Biochem.，1992，204(2):433-451.

［46］Ryan C A.Proteolytic enzymes and their inhibitors in plants［J］.Annu.Rev.Plant Physiol.，1973，24:173-196.

［47］Dunaevskii Y E，Pavlikova E B，Belyakova G A et al.Physiological role of protease inhibitors in plants:two groups of active inhibitors in buckwheat seed［J］.Mol.Biol.，1995，29(6):747-750.

［48］Mezhlum＇yan L G，Redina é F，Yuldashev P Kh.Functions of inhibitors of proteolytic enzymes in plants［J］.Chem.Nat.Compd.，1997，33(1):31-35.

［49］Ledoigt G，Griffaut B，Debiton E et al.Analysis of secreted protease inhibitors after water stress in potato tubers［J］.Int.J.Biol.Macromol.，2006，38:268-271.

［50］Bowler C，Montagu M V，Lnze D.Superoxide dismutase and stress tolerance［J］.Annu.Rev.Plant Physiol.Mol.Biol.，1992，43:83-116.

［51］Alscher R G，Donahue J L，Cramer C L.Reactive oxygen species and antioxidants:relationships in green cells［J］.Physiol.Plant.，1997，100(2):224-233.