紫外分光光度法測定甘草中總黃酮的含量

高 宏，贠亞波，兀江波，曹峽萍（三門峽市中醫(yī)院藥劑科，河南三門峽 472000）

紫外分光光度法測定甘草中總黃酮的含量

高 宏＊，贠亞波，兀江波，曹峽萍（三門峽市中醫(yī)院藥劑科，河南三門峽 472000）

目的：建立甘草總黃酮的含量測定方法。方法：以甘草苷為對照品，以10%KOH溶液為顯色劑，優(yōu)化顯色時間、顯色劑用量，并最終建立紫外分光光度法測定甘草總黃酮。結(jié)果：確定最佳的顯色劑用量為1.5mL、顯色時間為15min；甘草苷的進樣濃度在0.012～0.030mg·mL－1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系（r＝0.9998），平均加樣回收率為99.0%，RSD＝2.60（n＝9）。結(jié)論：該方法快速、簡單、有效，適用于甘草總黃酮含量的測定。

甘草；總黃酮；含量測定；紫外分光光度法；甘草苷

甘草系豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensia Fisch.、脹果甘草G.inflate Bat.或光果甘草G.glabra L.的干燥根及根莖[1]。甘草有效部位的提取一直是研究的熱點，其有效成分主要以二氫黃酮類和查爾酮類化合物為主，在抗氧化、保肝、抗腫瘤方面有著很好的藥理活性。對于其總黃酮的檢測方法多以蘆丁為對照品[2]；若以柚皮苷[3]為對照品，因其不是甘草中的有效成分，所以檢測結(jié)果存在較大差異。筆者嘗試以甘草苷作為對照品，采用紫外分光光度法測定甘草中總黃酮的含量。

1 儀器與試藥

8453型紫外-可見分光光度計（美國安捷倫公司）；TDA-8002型電熱恒溫水浴鍋（余姚市東方電工儀器廠）；KQ300DA型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率：300W，頻率：53kHz）。

甘草苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111610-200503）；氫氧化鈉、氫氧化鉀、無水乙醇均為分析純；甘草購于安徽亳州市永剛飲片廠有限公司（批號及產(chǎn)地：20110301，內(nèi)蒙古阿拉善；20110415，寧夏鹽池；20110510，新疆巴楚），粉碎，過100目篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱定已干燥的甘草苷對照品適量，用70%乙醇溶解并定容于25mL量瓶中，制得濃度約為0.15mg·mL－1的對照品溶液。搖勻后冰箱中貯藏，備用。

2.2 供試品溶液的制備

取甘草粉末（批號：20110510）約0.2g，精密稱定，置50mL量瓶中，加70%乙醇45mL，超聲處理30min，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 最大吸收峰的確定

精密吸取甘草苷對照品溶液1.0mL，加入10%KOH溶液1.0mL，用70%乙醇稀釋至5mL，搖勻后室溫放置5min。另取甘草苷對照品溶液1.0mL，置5mL量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，作為空白對照。2種溶液于190～500nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在407nm波長處有最大吸收（見圖1）。

精密吸取供試品溶液0.5mL，置5mL量瓶中，加入10%KOH溶液1.0mL，用70%乙醇稀釋至5mL，搖勻后室溫放置5min。再取供試品溶液0.5mL，直接用70%乙醇定容至5mL，作為空白對照。2種溶液于190～900nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在407nm波長附近有最大吸收（見圖1）。

圖1 紫外吸收光譜圖1.甘草苷對照品；2.供試品Fig 1 UV absorption spectrum1.liquiritin control；2.test sample

綜上，選取407nm為檢測波長。

2.4 顯色劑用量及顯色時間的確定

精密吸取對照品溶液1mL，置于5mL量瓶中，分別加10%氫氧化鉀溶液0.8、1.0、1.25、1.5mL，立刻加70%乙醇定容。另取對照品溶液1mL，加70%乙醇至5mL，作為空白對照。每隔2.5min在407nm波長處測定各溶液的吸光度。結(jié)果表明，加入10%氫氧化鉀溶液1.5mL稀釋后，放置時間15min，吸光度值趨于穩(wěn)定，故本試驗選擇顯色劑的用量為1.5mL、顯色時間為15min。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取甘草苷對照品溶液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL，分別加入10%KOH溶液1.5mL，用70%乙醇稀釋至5mL，室溫放置15min，在407nm波長處測定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，對照品的濃度（X，mg·mL－1）為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝21.9974X－0.0055（r＝0.9998，n＝7）。結(jié)果表明，甘草苷的進樣濃度在0.012～0.030mg·mL－1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.6 重復(fù)性試驗

精密吸取同一批（批號：20110510）供試品溶液6份，每份0.4mL，按“2.5”項下方法操作；再吸取同量供試品溶液，直接用70%乙醇定容至5mL，作為空白對照，于407nm波長處測定吸光度。結(jié)果，樣品中總黃酮含量為2.79%，RSD＝1.45%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好，

2.7 精密度試驗

精密吸取對照品溶液適量，按“2.5”項下方法制得顯色溶液，取各顯色溶液及其空白溶液于407nm波長處測定，共操作5次，以吸光度值計算。結(jié)果，RSD＝1.1%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液（批號：20110510）適量，分別于0、1、2、3、4、6、8h顯色，按“2.5”項下方法測定吸光度。結(jié)果，RSD＝1.46%（n＝7），表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量（2.79%）的甘草樣品（批號：20110510）9份，每份0.1g，精密加入甘草苷對照品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.5”項下方法操作，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（n＝9）

2.10 樣品含量測定

取不同批號甘草粉末各約0.2g，精密稱定，置50mL量瓶中，加70%乙醇45mL，超聲處理30min，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻，濾過。精密吸取濾液0.5mL，加入1.5mL 10%KOH溶液1.5mL，用70%乙醇稀釋至5mL，室溫放置15min，于407nm波長處測定吸光度，計算樣品含量。結(jié)果，3批甘草藥材（批號：20110301、20110415、20110510）中總黃酮的含量分別為6.08%、2.82%、2.79%（n＝3）。

3 討論

2010年版《中國藥典》中甘草的含量測定方法為檢測甘草苷和甘草酸的含量，對于其所含的黃酮類化合物并無檢測方法。采用紫外分光光度（UV）法測定甘草中總黃酮多用蘆丁作對照品[2]、亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色。但是，筆者對采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色后的甘草苷對照品溶液進行掃描，發(fā)現(xiàn)其最大吸收峰出現(xiàn)在400nm左右波長處；而用蘆丁作對照品顯色后測定的波長在500nm以上，產(chǎn)生誤差較大，效果不理想。又有用柚皮苷[3]作對照品、氫氧化鉀顯色測定甘草中總黃酮含量的方法，但是甘草中可能沒有柚皮苷，影響試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。還有用甘草苷作對照品、氫氧化鈉顯色的方法[4]，利用甘草中黃酮類成分主要為甘草苷，而甘草苷為二氫黃酮類成分，遇到堿性試劑轉(zhuǎn)變?yōu)椴闋柾@紫紅色。但是試驗結(jié)果證明用氫氧化鈉作顯色劑，堿性不如氫氧化鉀強，所測吸光度浮動范圍較大，不如氫氧化鉀作顯色劑穩(wěn)定。經(jīng)綜合考慮，筆者選用甘草苷為對照品，以氫氧化鉀作為顯色劑測定甘草中總黃酮的含量，該方法穩(wěn)定、簡單、快速、有效。

樣品藥材中產(chǎn)自內(nèi)蒙古的為野生甘草，其余的均為家種甘草，從結(jié)果看野生甘草中總黃酮的含量較高。2005年版《中國藥典》規(guī)定甘草中甘草苷的含量不得少于1%[5]，而2010年版《中國藥典》規(guī)定甘草中甘草苷的含量不得少于0.5%。通過筆者對甘草質(zhì)量的研究發(fā)現(xiàn)，若按照2005年版《中國藥典》的規(guī)定，全國相當(dāng)一部分甘草中甘草苷的含量達不到此要求；2010年版《中國藥典》降低標(biāo)準(zhǔn)或為此原因。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：80.

[2] 封士蘭.甘草黃酮的提取分離和含量測定[J].蘭州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1998，24（4）：20.

[3] 張雪輝，趙元芬，陳建民.甘草中總黃酮的含量測定[J].中國中藥雜志，2001，26（11）：746.

[4] 韓 博，陳 文，翟科峰，等.甘草苷作對照品測定烏拉爾甘草中總黃酮的含量[J].石河子大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，24（4）：472.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：60.

Content Determination of Total Flavonoids from Radix Et Rhizoma Glycyrrhizae by UV Method

GAO Hong，YUAN Ya-bo，WU Jiang-bo，CAO Xia-ping（Dept.of Pharmacy，Sanmenxia Hospital of TCM，Henan Sanmenxia 472000，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of total flavonoids from Radix Et Rhizoma Glycyrrhizae.METHODS：Liquiritin and 10%KOH solution were used as substance control and color reagent to optimize color developing time and amount of color reagent.At last，UV spectrophotometry was established for the content determination of total flavonoids from Radix Et Rhizoma Glycyrrhizae.RESULTS：Optimal amount of color reagent was 1.5mL and color developing time was 15min；the linear range of liquiritin was 0.012～0.030mg·mL－1（r＝0.9998）with an average recovery of 99.0%（RSD＝2.60，n＝9）.CONCLUSION：The method is rapid，simple and effective，and it is suitable for the content determination of content determination of total flavonoids from Radix Et Rhizoma Glycyrrhizae.

Radix Et Rhizoma Glycyrrhizae；Total flavonoids；Content determination；UV spectrophotometry；Liquiritin

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2012）07-0642-02

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.07.24

＊副主任藥師。研究方向：藥品質(zhì)量鑒定，臨床藥學(xué)。電話：0398-2843570。E-mail：zyyyjk@163.com

2011-09-22

2011-12-27）