細(xì)胞自噬的研究進(jìn)展

孫雅婧，郭青龍

中國(guó)藥科大學(xué)生理教研室，南京 210009

細(xì)胞自噬（autophagy）是指細(xì)胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w，溶酶體對(duì)其消化降解，以胞質(zhì)內(nèi)自噬體的出現(xiàn)為標(biāo)志的細(xì)胞自我消化過程，以雙層膜結(jié)構(gòu)包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞器的自噬體為判斷指標(biāo)。早在1962年，自噬現(xiàn)象的奠基人Ashford和Porten在人的肝細(xì)胞中用電子顯微鏡觀察到了自噬現(xiàn)象。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)自噬的形態(tài)特點(diǎn)和分子機(jī)制了解逐步深入。近年來(lái)對(duì)自噬的研究十分廣泛，自噬是在體內(nèi)普遍存在的過程，其在清除代謝廢物進(jìn)而回收能量為細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn)提供能量的過程中發(fā)揮重要作用，因而對(duì)自噬的研究尤為重要。

1 細(xì)胞自噬的研究現(xiàn)狀

1.1 自噬的過程

自噬的過程分為四個(gè)階段（見圖1）。

第一階段：自噬誘導(dǎo)信號(hào)被細(xì)胞接受后，類“脂質(zhì)體”碗狀結(jié)構(gòu)即在胞漿某處形成小的膜結(jié)構(gòu)，在電鏡下觀察到其不斷擴(kuò)張、呈非球形、扁平狀雙層膜的碗狀結(jié)構(gòu)，稱為自噬前體（phagophore），這種結(jié)構(gòu)的電鏡觀察結(jié)果是指示自噬發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)之一。

第二階段：不斷延伸的自噬前體，將胞漿中的若干成分（包括細(xì)胞器）收口包入，成為密閉的球狀自噬體（autophagosome）。自噬體的電鏡觀察結(jié)果是指示自噬發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)之一。自噬體的特征有兩個(gè)：雙層膜，內(nèi)含諸如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片等胞漿成分。

第三階段：自噬體形成后，可能與細(xì)胞內(nèi)吞的吞噬泡（phagocytic vacuole）、吞飲泡（pinosome）和內(nèi)體（endosome）融合（此階段為非必需步驟）。

第四階段：自噬體與溶酶體（lysosome）發(fā)生融合，形成自噬溶酶體（autolysosome）。期間溶酶體酶降解自噬體的內(nèi)膜，使兩者的內(nèi)容物合為一體，自噬體中的包含物被降解，將產(chǎn)物諸如氨基酸、脂肪酸之類輸送到胞漿中，重新利用供能，殘?jiān)鼊t被排出細(xì)胞外或滯留于胞漿[1]。

圖1 自噬的基本過程

1.2 自噬的分類

根據(jù)細(xì)胞內(nèi)底物運(yùn)送到溶酶體腔方式的不同，哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬分為3種主要方式：巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侶介導(dǎo)自噬（chaperone-mediated autophagy，簡(jiǎn)稱CMA）。巨自噬是最主要的自噬形式，在巨自噬中由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來(lái)源的膜包繞待降解物，形成自噬體后與溶酶體融合并降解其內(nèi)容物；然而在微自噬中，溶酶體膜直接內(nèi)陷包裹長(zhǎng)壽命蛋白等，并在溶酶體內(nèi)降解，沒有形成自噬小體的過程；分子伴侶介導(dǎo)自噬則為胞漿內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中，被溶酶體酶消化。CMA的底物是可溶蛋白分子，因此CMA降解途徑在清除蛋白質(zhì)時(shí)有選擇性，而前兩者無(wú)明顯的選擇性[3]。

2 自噬與凋亡

在多細(xì)胞生物體內(nèi)，維持自身的穩(wěn)態(tài)和內(nèi)環(huán)境的平衡，是保持復(fù)雜生物體系正常運(yùn)轉(zhuǎn)的重要條件。正常的細(xì)胞體系當(dāng)中，有細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖必然伴隨著細(xì)胞的衰老和死亡，細(xì)胞死亡包括3種類型：壞死、凋亡和自噬性細(xì)胞死亡?；铙w內(nèi)局部組織、細(xì)胞的死亡稱為壞死（necrosis）；壞死組織細(xì)胞的代謝停止，功能喪失；壞死的形態(tài)變化可由損傷細(xì)胞內(nèi)的水解酶降解作用引起，也可由游走的白細(xì)胞釋放水解酶作用引起，以細(xì)胞核的改變?yōu)樾螒B(tài)學(xué)標(biāo)志。凋亡，即Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡的特征，主要有依賴一系列蛋白水解酶即胱冬肽酶（caspase）參與，染色體濃聚、細(xì)胞皺縮、DNA降解和凋亡小體形成等，其細(xì)胞的殘余部分最終被巨噬細(xì)胞清除。自噬性細(xì)胞死亡，即Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，以自噬體的出現(xiàn)為特征，不依賴于一系列蛋白水解酶即胱冬肽酶的參與，自噬體和其內(nèi)的成分最終通過自身溶酶體系統(tǒng)被清除[4]。因此，自噬和凋亡無(wú)論在生化代謝途徑，還是形態(tài)學(xué)方面都有顯著區(qū)別，但研究證實(shí)，兩者在功能上存在聯(lián)系：在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的過程中，細(xì)胞凋亡和自噬保持著動(dòng)態(tài)平衡，即自噬可能為凋亡所需，自噬通常先于凋亡，進(jìn)而啟動(dòng)凋亡；自噬亦可能抑制凋亡作用，可保護(hù)細(xì)胞免于發(fā)生凋亡和壞死；自噬還可能向凋亡轉(zhuǎn)化，共同促進(jìn)細(xì)胞死亡。

大量證據(jù)還表明，自噬可能延遲凋亡的發(fā)生，抑制自噬作用可能誘發(fā)凋亡現(xiàn)象，同時(shí)抑制凋亡作用，也可能導(dǎo)致自噬現(xiàn)象的發(fā)生[5-6]。

3 自噬與腫瘤

自噬現(xiàn)象在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮著“雙刃劍”的作用。自噬對(duì)于腫瘤的具體影響不可一概而論，不能簡(jiǎn)單將其劃分為“有益的”和“有害的”，據(jù)研究表明，自噬對(duì)于腫瘤的影響是分階段和有針對(duì)性的。

3.1 自噬對(duì)腫瘤的抑制作用

正常的多細(xì)胞生物體中，進(jìn)行正常的能量代謝和生物活動(dòng)同時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生一些不必要的老化細(xì)胞器或蛋白及代謝物，自噬在清除代謝廢物進(jìn)而回收能量，為細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn)提供能量的過程中發(fā)揮著重要作用。如果自噬作用受影響，細(xì)胞一些正常代謝活動(dòng)不能正常進(jìn)行，生物體自發(fā)性腫瘤的發(fā)生幾率便可能增多。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤發(fā)生與自噬缺陷有關(guān)：如自噬相關(guān)基因BECN為雜合子的小鼠發(fā)生自發(fā)性惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增高；乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌以及白血病患者中，Beclin-1等位基因缺失的比例高于健康人[7-9]。在部分膠質(zhì)瘤患者當(dāng)中，Beclin-1蛋白 （BECN編碼蛋白）和微管相關(guān)蛋白質(zhì)輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP-LC3）的表達(dá)均降低[10]。

其他與自噬相關(guān)基因的變化情況也有研究涉及。例如，在自然殺傷性白血病中的自噬相關(guān)基因5（autophagy-related gene5，Atg5）， 在胃癌和結(jié)直腸癌中的紫外線抵抗相關(guān)腫瘤抑制基因（UV radiation resistance-associated gene，UVRAG），人胰管癌中的腫瘤抑制基因Bax作用子 （Bax-interacting factor-1，Bif-1）[11-13]?？傊A(chǔ)性的自噬對(duì)于癌癥發(fā)生的早期階段起著積極的對(duì)抗作用。

3.2 自噬對(duì)腫瘤的促進(jìn)作用

當(dāng)腫瘤已經(jīng)發(fā)生，在腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)由于嚴(yán)重代謝壓力造成的自噬時(shí)，腫瘤細(xì)胞的數(shù)量會(huì)不斷增加。自噬為生活環(huán)境惡劣的腫瘤細(xì)胞提供了有效的供養(yǎng)途徑，使腫瘤細(xì)胞能夠在低氧和低養(yǎng)分的微環(huán)境、尤其是缺乏血液供氧和供養(yǎng)分的環(huán)境下繼續(xù)生存，使得腫瘤能夠抵抗外界壓力進(jìn)行發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。細(xì)胞與胞外基質(zhì)或者毗鄰細(xì)胞脫離接觸而誘發(fā)的特殊細(xì)胞程序性死亡稱之為 “失巢凋亡（anoikis）”，而腫瘤細(xì)胞能夠克服這種失巢凋亡，在血管缺失的情況下繼續(xù)存活，而自噬作用是其作用機(jī)制之一[15]。多項(xiàng)體內(nèi)和體外研究表明，在脫離細(xì)胞外基質(zhì)、缺氧、缺養(yǎng)分的情況下，凋亡缺陷的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出驚人的逆境生存能力，這種強(qiáng)大的生存能力與自噬機(jī)制密切相關(guān)。自噬為腫瘤細(xì)胞提供庇護(hù)，通過多種途徑抑制自噬可能將提高腫瘤對(duì)放療、化療、免疫治療的敏感性[16-18]。

4 自噬在抗癌藥物介導(dǎo)的細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要的作用

鑒于自噬在腫瘤中特殊的作用和地位，研究其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的分子調(diào)控至關(guān)重要。在正常細(xì)胞中，雷帕霉素靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR） 作為磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的下游分子，在自噬中起著最初的調(diào)節(jié)作用。在生長(zhǎng)因子的作用下，活化的PI3K/AKT/mTOR軸抑制自噬并刺激細(xì)胞的增殖。相反，在饑餓狀況下PI3K通路被抑制，自噬被激活，細(xì)胞內(nèi)的各種能量代謝過程受到影響，代謝處于短暫快速供能以維持細(xì)胞基本存活需要。腫瘤細(xì)胞中的自噬調(diào)節(jié)機(jī)理類似，但是過程和方式更為復(fù)雜：在腫瘤細(xì)胞中的PI3K異常激活，PI3K/AKT/mTOR途徑和其他細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)之間的相互作用失衡，從而引起了細(xì)胞內(nèi)多種異常狀況的發(fā)生[19]?；谶@種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常，自噬在抗癌藥物介導(dǎo)的細(xì)胞死亡中發(fā)揮著重要的作用，主要有以下兩個(gè)方面：

4.1 自噬與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡

Hanahan和Weinberg將自噬和壞死與凋亡并稱為細(xì)胞死亡的幾種方式[20]，但自噬和凋亡的相互關(guān)系未有定論。另有研究指出，自噬和凋亡可能受共同的上游信號(hào)調(diào)控，可能被同一個(gè)關(guān)鍵分子調(diào)節(jié)，Beclin-1是其中一個(gè)關(guān)鍵分子[21]。因而對(duì)于化療藥物所誘導(dǎo)的自噬和凋亡的研究相對(duì)具有針對(duì)性，但是在不同的藥物作用于不同的細(xì)胞株當(dāng)中，所誘導(dǎo)的自噬現(xiàn)象發(fā)揮的作用也不盡相同：抗凋亡、促生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

化療藥物誘導(dǎo)自噬的機(jī)制研究未有定論，化療藥物如DNA損傷劑、微管干擾分子和激酶抑制劑也因其種類不同誘導(dǎo)自噬的機(jī)制也有所不同。比較公認(rèn)的通路是P53的活化在轉(zhuǎn)錄水平上增加了調(diào)節(jié)自噬通路的相關(guān)蛋白，如腺苷單磷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、凋亡相關(guān)蛋白激酶1（death-associated protein kinase 1，DAPK1）、結(jié)節(jié)性硬化蛋白 2（tuberous sclerosis protein 2，TSC2）、unc-51 樣激酶 （unc-51-like kinase 1/2，ULK 1/2）和 SESN 基因編碼蛋白 1/2（sestrin 1/2）的表達(dá)[22]。

自噬與凋亡共同參與各種抗癌化療方式誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，在某一些實(shí)例中完整的自噬機(jī)制是細(xì)胞死亡的必需步驟。在不同的細(xì)胞株，諸如肝癌細(xì)胞[23]、宮頸癌細(xì)胞[24]、甲狀腺腫瘤細(xì)胞[25]等給予不同的化療藥物后，自噬可能扮演了促進(jìn)細(xì)胞死亡的作用。上述研究證明，凋亡缺失的細(xì)胞中自噬性死亡成為細(xì)胞死亡的主要途徑。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均證實(shí)，腫瘤組織的缺氧環(huán)境影響著抗癌藥物的作用效果[26]。出現(xiàn)這種抵抗的原因可能是對(duì)凋亡的抑制，從而引起了缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）轉(zhuǎn)錄水平活化。隨著越來(lái)越多的研究涉及自噬參與化療藥物引起細(xì)胞死亡，更多研究聚焦于抗癌藥物引起的自噬中缺氧情況的變化。腫瘤組織中的持續(xù)缺氧可能擾亂凋亡和自噬兩者間在細(xì)胞死亡中的平衡狀態(tài)，進(jìn)而引起一系列的變化[27]。

4.2 自噬的細(xì)胞保護(hù)作用

自噬作用能使腫瘤細(xì)胞在惡劣的微環(huán)境中得以生存，并使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥作用。在某些給予抗腫瘤藥的腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到了自噬現(xiàn)象的大量發(fā)生[28]。在那些細(xì)胞中給予自噬抑制劑可更能有效地提高抗癌藥物的治療效果，具體機(jī)制研究尚無(wú)定論。

自噬抑制可減少腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的抵抗機(jī)制，可能源于細(xì)胞死亡中的一個(gè)關(guān)鍵分子開關(guān)。瀕死細(xì)胞釋放損害關(guān)聯(lián)模式分子（damage-associated molecular pattern molecules，DAMPs），其中一種稱為高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）。這種蛋白通過晚期糖化終產(chǎn)物受體 （receptor for advanced glycation endproducts，RAGEs），作用于其他分子誘導(dǎo)自噬和耐藥。此作用途徑目前僅發(fā)現(xiàn)于白血病細(xì)胞[29]，其他腫瘤細(xì)胞尚未有相關(guān)研究。

5 自噬現(xiàn)象的臨床意義

隨著自噬現(xiàn)象研究的深入，自噬漸漸成為一個(gè)新的癌癥治療靶點(diǎn)。如前所述，半數(shù)研究表明，自噬是抗癌治療中有效殺傷腫瘤細(xì)胞所必需的。研究者期望設(shè)計(jì)出新的藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自我吞噬，甚至寄希望于自噬可以清除腫瘤細(xì)胞。某些以通過誘導(dǎo)自噬達(dá)到影響腫瘤細(xì)胞作用的藥物將要作進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)[30]。

化療藥物使用后，腫瘤細(xì)胞中自噬現(xiàn)象的大量產(chǎn)生預(yù)示著一種細(xì)胞的自我保護(hù)反應(yīng)，以自噬體的形成與融合為靶點(diǎn)的治療藥物為腫瘤化療提供了一條新思路和新途徑[31]。因而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬的藥物，在腫瘤的預(yù)防和治療初期階段有著廣闊的前景和極其重要的意義。

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