澳洲長鰭鰻4種同工酶的組織特異性研究

澳洲長鰭鰻4種同工酶的組織特異性研究

運用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法對澳洲長鰭鰻(Anguillareinhardtii)5種組織(心臟、肝臟、肌肉、眼和腎臟)的4種同工酶[酯酶(EST)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、過氧化物酶(POD)、蘋果酸脫氫酶(MDH)]進(jìn)行了研究，并對其同工酶位點及酶譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，澳洲長鰭鰻的4種同工酶具有不同程度的組織特異性。EST檢測到16個位點，多個位點存在等位基因。G6PDH檢測到2個基因位點，其中1個位點存在等位基因。POD有3個位點，Pod-3檢測到2個等位基因。MDH具有s-MDH和m-MDH 2種類型，s-MDH形成2種二聚體；m-MDH形成4種二聚體。這4種同工酶在表型、分布和活性上均表現(xiàn)出明顯的組織特異性，可能與各組織執(zhí)行的生理機能相關(guān)。

澳洲長鰭鰻(Anguillareinhardtii)；同工酶；組織特異性

中國鰻魚養(yǎng)殖以歐洲鰻鱺和日本鰻鱺為主，總產(chǎn)量居世界第一，約占世界總產(chǎn)量的70%。世界各國養(yǎng)殖的鰻魚苗種只能依靠近海的天然鰻苗資源，目前日本鰻鱺和歐洲鰻鱺苗種捕撈資源嚴(yán)重不足，無法滿足現(xiàn)有養(yǎng)殖規(guī)模[1-3]。澳洲長鰭鰻(Anguillareinhardtis，英文名Australian longfin eel)隸屬鰻鱺科鰻鱺屬，產(chǎn)于澳大利亞東南部、洛德豪島、新喀里多尼亞。因其形體大，俗稱長鰭鰻、龍鰻。該品種生長速度快、性情溫和、易于飼養(yǎng)、味道鮮美，是一種名貴鰻魚，現(xiàn)在國內(nèi)已有少數(shù)單位進(jìn)行養(yǎng)殖和開發(fā)，具有良好的養(yǎng)殖開發(fā)前景。如能進(jìn)行推廣，可緩解當(dāng)前日本鰻鱺和歐洲鰻鱺苗種不足的情況。目前對澳洲長鰭鰻的研究很少，本研究采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法探討了澳洲長鰭鰻4種同工酶在5種組織中的分布、類型、活性等，以期為澳洲長鰭鰻的種質(zhì)資源鑒定和遺傳結(jié)構(gòu)分析提供有價值的生化指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用魚取自山東省淡水水產(chǎn)研究所，體長25～45cm，體重376～928g。

1.2 樣品制備

取試驗用魚共30尾，剪斷尾動脈和鰓，在流水中放血以減少組織帶血，然后迅速摘取眼睛、心臟、腎臟、肝臟、肌肉等組織，用預(yù)冷的0.8%生理鹽水將各組織沖洗干凈，取適量稱重，放入預(yù)冷的研缽中，用消毒的剪刀剪碎，加入預(yù)冷的0.01mol/L的pH7.4的磷酸緩沖液(組織∶緩沖液=1g∶3ml)，冰浴中研磨，研磨成漿后置4℃抽提1～2h，4℃15000r/min離心30min，取上清液，加入等體積的40%的蔗糖溶液，分裝，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 電泳及染色

采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法，分離膠濃度(T)為7.0%或7.5%，濃縮膠濃度為4%或3%。電泳緩沖液為Tris-Gly，高離子強度電泳緩沖液(pH8.3)或低離子強度電泳緩沖液(pH8.7)。梯度膠的濃度和緩沖系統(tǒng)見表1，點樣量為20μl，以溴酚藍(lán)作指示劑，電泳在4℃冰箱進(jìn)行。同工酶的染色方法參照文獻(xiàn)[4-7]稍作改進(jìn)。同工酶的命名和分析參照文獻(xiàn)[7-8]，以各酶帶的相對遷移率(Rf)從小到大依次命名，即向陽極泳動最快的編為1號，依次順序編為2、3、4、…，同一基因位點的不同等位基因按照從陰極到陽極的順序依次標(biāo)記為a、b、c、…。

對澳洲長鰭鰻5種組織的4種酶類進(jìn)行多次電泳，篩選出酶譜清晰的結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 用于分析澳洲長鰭鰻同工酶的名稱、編號、緩沖系統(tǒng)和凝膠濃度

注：TG8.3指Tris-甘氨酸高離子強度電泳緩沖液(pH8.3)；TG8.7指Tris-甘氨酸低離子強度電泳緩沖液(pH8.7)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯酶(EST)

L:肝臟(liver)；H:心臟(heart)；K:腎臟(kidney)；M:肌肉(muscle)；E:眼睛(eye)

魚類的酯酶較復(fù)雜，一般認(rèn)為是單體酶或多聚體酶，由多個基因位點編碼[9]，多態(tài)現(xiàn)象非常普遍[7]。從澳洲長鰭鰻不同組織的EST電泳圖譜(圖1)可以看出，EST在澳洲長鰭鰻的心臟、肝臟、肌肉、眼和腎臟中都有分布，共有16個位點；肝臟和腎臟EST表達(dá)豐富，肝臟有12條酶帶，腎臟有13條酶帶，心臟和眼中表達(dá)次之，心臟8條酶帶，眼中7條酶帶，肌肉中表達(dá)最弱，有7條酶帶。Est-9和Est-10這2個位點在5種組織中都表達(dá)，且都有2個等位基因，Est-6在肝臟中有2種基因型aa、bb，在腎臟中只有1種基因型aa。

2.2 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)

G6PDH為二聚體酶[10]，由G6pdh-1、G6pdh-2這2個基因座位編碼。澳洲長鰭鰻的G6PDH在肝臟和腎臟中表達(dá)，G6pdh-1在肝臟表達(dá)很弱，腎臟表達(dá)較明顯，且表現(xiàn)出2種基因型，G6pdh-2在肝臟表達(dá)量較大，腎臟表達(dá)很弱(圖2)，組織差異性顯著。

L:肝臟(liver)；H:心臟(heart)；S:脾臟(spleen)；K:腎臟(kidney)；M:肌肉(muscle)；E:眼睛(eye)

2.3 過氧化物酶(POD)

POD是一類清除細(xì)胞內(nèi)H2O2的同工酶，具體為幾聚體還未有定論，有學(xué)者認(rèn)為是二聚體酶[9,11]。澳洲長鰭鰻的POD有3個位點，分別為Pod-1、Pod-2、Pod-3，其中Pod-1和Pod-2只在心臟中表達(dá)，Pod-3在5個組織中都表達(dá)，有2個等位基因(圖3)。

2.4 蘋果酸脫氫酶(MDH)

硬骨魚的蘋果酸脫氫酶為二聚體，存在有相互不形成異聚體的上清液型(s-MDH)和線粒體型(m-MDH)2部分，均是由2基因編碼的二聚體[12]。澳洲長鰭鰻的MDH也具有s-MDH和m-MDH 2種類型(圖4)，s-MDH形成2種二聚體，s-Mdh1在心臟和腎臟中表達(dá)，s-Mdh2在心臟和肌肉中表達(dá)；m-MDH形成4種二聚體，m-Mdh1僅在肝臟中表達(dá)，m-Mdh2在心臟和肝臟中表達(dá)，m-Mdh3在心臟、肝臟、眼、腎臟中都表達(dá)，m-Mdh4僅在眼中表達(dá)，澳洲長鰭鰻的MDH在不同組織中的表達(dá)差異顯著。

L:肝臟(liver)；H:心臟(heart)；K:腎臟(kidney)；M:肌肉(muscle)；E:眼睛(eye)

L:肝臟(liver)；H:心臟(heart)；K:腎臟(kidney)；M:肌肉(muscle)；E:眼睛(eye)

3 討論

3.1澳洲長鰭鰻不同組織同工酶表達(dá)的特異性及其與功能的關(guān)系

EST屬于水解酶類，能催化酯鍵水解，對于脂類代謝和生物膜的結(jié)構(gòu)與功能具有一定作用[13]。一般認(rèn)為在硬骨魚類中EST是單體或二聚體，由多個位點編碼，多態(tài)現(xiàn)象非常普遍。澳洲長鰭鰻腎臟和肝臟中EST的含量比較豐富，這和赤點石斑魚、暗紋東方鲀、青海湖裸鯉等魚類的EST表達(dá)類似[9,14-15]，可能與肝、腎組織脂類代謝和機體的解毒作用密切相關(guān)。同時，從澳洲長鰭鰻EST的表達(dá)酶譜上看，與其他已報道的魚類相比，澳洲長鰭鰻EST表達(dá)量大，且酶帶很多，這可能與澳洲長鰭鰻體內(nèi)脂肪含量豐富、脂類代謝旺盛相關(guān)。龍華等[16]曾報導(dǎo)過歐洲鰻和日本鰻肝臟、心臟和肌肉中的EST酶譜；與澳洲長鰭鰻相比，歐洲鰻和日本鰻這3種組織中的EST表達(dá)不及澳洲長鰭鰻EST表達(dá)豐富，3種鰻魚的EST表達(dá)有顯著區(qū)別，因此，肝臟、心臟的EST表達(dá)酶譜可用于鑒別澳洲長鰭鰻、歐洲鰻和日本鰻。

隨著科技的迅猛發(fā)展和科技產(chǎn)品在生活領(lǐng)域的深入,一些新興的“科技疾病”已經(jīng)悄然出現(xiàn)在疾病譜之中。如:夏季的“空調(diào)病”,智能手機所帶來的“手機拇指病”等。近年來,“加濕性肺炎”這個新興的科技疾病走入了人們的視線,“加濕性肺炎”并非專業(yè)醫(yī)學(xué)名詞,也并非單指肺炎,與加濕器也無必然聯(lián)系,而是因加濕器使用不當(dāng)造成的呼吸道系統(tǒng)的一系列疾病。包括上呼吸道感染、支氣管炎、哮喘、肺炎等。孕、產(chǎn)婦是一特殊群體,在現(xiàn)今社會受到了家屬的“盲目關(guān)心”,而家屬醫(yī)學(xué)知識的匱乏或不良的使用方式,可能在無意中損害了孕婦的身體健康。

G6PDH為二聚體酶，是糖代謝中磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，該途徑產(chǎn)生的NAPDH能被細(xì)胞廣泛用來驅(qū)使還原性厭氧途徑，為生物合成提供動力，如脂肪酸、固醇類物質(zhì)的合成等，產(chǎn)生的磷酸戊糖參與核酸代謝[17]。澳洲長鰭鰻的G6PDH在肝臟和腎臟中表達(dá)，肝臟中G6pdh-2表達(dá)量較大，腎臟中G6PDH表達(dá)很弱，但G6pdh-1表現(xiàn)出多態(tài)性，其他組織未見表達(dá)或表達(dá)太弱，現(xiàn)使用的檢測方法無法檢出，澳洲長鰭鰻G6PDH的表達(dá)組織差異性顯著。澳洲長鰭鰻G6PDH的表達(dá)情況與與已報道的鱸魚、虹鱒等魚類表達(dá)類似[10,12]，都是肝臟中活性最強，這應(yīng)與肝臟的功能密切相關(guān)。

POD是一類清除細(xì)胞內(nèi)H2O2的同工酶，其主要功能是清除氨基酸分解代謝及糖醛酸合成代謝等過程中形成的過氧化物。動物的甲狀腺細(xì)胞、具有吞噬功能的白細(xì)胞等含有豐富的過氧化物酶，因此在血流豐富、白細(xì)胞及吞噬細(xì)胞含量較多的心臟、肝臟、腎臟中同工酶POD的表達(dá)較強，而肌肉中表達(dá)較弱或無表達(dá)[9]。澳洲長鰭鰻的POD由3個基因座位編碼，心臟中表達(dá)最為強烈且Pod-1、Pod-2、Pod-3都有表達(dá)，腎臟中POD活性也比較強，Pod-3在各種組織中均存在，可能在細(xì)胞中執(zhí)行最基本的功能。澳洲長鰭鰻的POD表達(dá)和已報導(dǎo)的暗紋東方鲀的POD表達(dá)[18]很類似。

MDH是糖代謝三羧酸循環(huán)過程中的重要酶類，在細(xì)胞中的功能主要是使蘋果酸脫氫參與糖酵解后的有氧代謝[19]。因此，MDH在心臟、肝臟等有氧代謝旺盛的組織中染色較深。從圖4可知，澳洲長鰭鰻肝臟和心臟中POD活性較強，腎臟次之，肌肉和眼中活性較弱，這與肝臟和腎臟有氧代謝旺盛密切相關(guān)。

3.2 澳洲長鰭鰻同工酶的表達(dá)具有明顯的組織特異性

綜上所述，通過澳洲長鰭鰻的4種同工酶研究可以看出，澳洲長鰭鰻這4種同工酶的表達(dá)在不同組織間差異性顯著，且這種表達(dá)上的特異性是與各組織的功能相一致的；同時，通過與已報導(dǎo)的日本鰻和歐洲鰻同工酶譜比較，發(fā)現(xiàn)肝臟、心臟的EST表達(dá)酶譜可用于鑒別澳洲長鰭鰻、歐洲鰻和日本鰻。

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Q55;Q959.46+9

A

1673-1409(2012)06-S014-04

2012-04-10

山東省科技攻關(guān)計劃項目(2009GG2GG09027)；山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目；水產(chǎn)種質(zhì)資源平臺運行服務(wù)項目。

李 嫻(1979-)，女，安徽蚌埠人，碩士，助理研究員，主要從事水產(chǎn)動物遺傳育種研究。

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.06.004