興奮劑生長激素檢測方法研究進(jìn)展

周鑫淼 謝敏豪

1 北京體育大學(xué)（北京 100084） 2 國家體育總局反興奮劑中心

人生長激素是人體自身分泌的重要的肽類激素。重組人生長激素不僅應(yīng)用于臨床醫(yī)療，也被濫用于體育運(yùn)動中，以提高運(yùn)動成績。生長激素的檢測方法一直是世界各國反興奮劑工作的研究熱點(diǎn)。

1 生長激素概況

人生長激素（hGH）是由腦垂體基底前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的肽類激素，在人體內(nèi)發(fā)揮著重要而多樣的生物學(xué)作用[1]。其主要作用為促進(jìn)人體生長，也參與蛋白質(zhì)、脂類及碳水化合物的代謝。其分泌方式呈脈沖式，分泌呈明顯的晝夜節(jié)律性變化，主要受生長激素釋放激素[2]或生長抑素[3]等激素的調(diào)控。

隨著蛋白重組技術(shù)的發(fā)展[4]，重組人生長激素（rhGH）取代了從尸體腦垂體分離hGH的方式，逐漸被應(yīng)用于臨床治療。目前，rhGH主要被用于治療幼兒及成人的生長激素缺乏癥，同時也被應(yīng)用于幼兒特納氏綜合征的治療、慢阻肺以及燒傷等嚴(yán)重創(chuàng)傷的治療中。近些年來，由于hGH具有蛋白同化、調(diào)節(jié)體成分的作用，rhGH已經(jīng)開始扮演“非治療用藥”的角色，用于抗衰老[1]。

2 hGH的分子生物學(xué)基礎(chǔ)及其亞型

2.1 hGH基因簇

hGH是由腦垂體分泌的最重要肽類激素，其基因簇位于人第17對染色體長臂，長46.83kb，包含5個與hGH相關(guān)的基因[5]，分別為GH-N，GH-V，CS-A，CS-B和CS-L。其中GH-N和GH-V為編碼hGH的基因；CS-A和CS-B編碼絨毛膜生長催乳素，CS-L表達(dá)量很低，沒有有效翻譯?；虼刂?個基因都是由5個外顯子和4個內(nèi)含子構(gòu)成的。GH-N在垂體表達(dá)，產(chǎn)生人體內(nèi)正常的hGH；GH-V、CS-A、CS-B在胎盤中表達(dá)，并且隨著孕期的增加表達(dá)量持續(xù)升高[6]。

2.2 hGH的亞型

2.2.1 22kD-hGH

hGH在人體內(nèi)有很多種類，其中最主要的，也是含量最高的是22kD-hGH，它是由GH-N轉(zhuǎn)錄后去掉26個氨基酸的信號肽得到的191個氨基酸的肽類激素，約占垂體hGH的70%～75%，占血液循環(huán)hGH的43%[6]；是一條單鏈非糖化的親水性球蛋白，相對分子量為22124d；包含了四個半胱氨酸（cys）殘基，這四個cys殘基在分子內(nèi)分別形成兩對二硫鍵（cys53-cys165,cys182-cys189），使分子具有一大一小兩個環(huán)。22 kD hGH的三級結(jié)構(gòu)包含4個反向平行的 螺旋，螺旋之間由易于延伸的片段連接[7，8]。

22kD-hGH作為hGH主要亞型，與受體結(jié)合，起促人體生長、合成及脂肪代謝的作用。

2.2.2 20kD-hGH

hGH在人體內(nèi)含量排在第二位的是20kD-hGH,它是由GH-N轉(zhuǎn)錄后mRNA選擇性剪接得到的，亦由人垂體分泌，其含量較22kD-hGH少，占血液循環(huán)中hGH的5%～10%。這種含有176個氨基酸殘基的單一肽鏈容易形成二聚體，包括同型二聚體和與22kD-hGH形成的異型二聚體。20kD-hGH較22kD-hGH少了N端第32～46位的15個氨基酸殘基，但是它仍然保持了原有的兩對二硫鍵，這樣使得20kD-hGH可以正常折疊并具有和22kD-hGH相似的分子結(jié)構(gòu)以及功能。但是由于與22kD-hGH相比，缺少了第1螺旋的C端以及第1螺旋與第2螺旋之間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此影響20kD-hGH與受體的結(jié)合能力[6]。

Hayakawa 等指出，20kD-hGH的促合成作用和22kD-hGH相當(dāng)[9]；此外，20kD-hGH具有促進(jìn)脂肪降解、促進(jìn)IGF-I生成以及調(diào)節(jié)免疫等功能。

2.2.3 5kD-hGH和17kD-hGH

相對分子量為5 kD和17 kD的hGH是由22 kD-hGH經(jīng)蛋白酶切割后得到的兩個片斷。5kD-hGH是22kD-hGH的氨基末端多肽，由N端1～43個氨基酸殘基組成；17kD-hGH則由第44～191位共148個氨基酸殘基組成。通過各種免疫方法檢測證實(shí)，二者在人垂體和血液中均有分布。

對嚙齒類動物及狗進(jìn)行的試驗(yàn)顯示，5kD和17kD hGH具有調(diào)節(jié)體內(nèi)糖代謝平衡的生理功能，在肥胖型小鼠模型或者垂體切除的小鼠中可以檢測到5 kD hGH有類似胰島素樣活性[10]；而17 kD hGH則可致肥胖黃鼠糖耐量異常，兩者均無促進(jìn)生長作用。

目前關(guān)于17kD的表述，說法不一。有的研究人員認(rèn)為，17kD-hGH在血液循環(huán)中有很高的濃度[11,12]，并且通過水解實(shí)驗(yàn)證明了體內(nèi)17kD的存在；同時，也有研究人員認(rèn)為，體內(nèi)并不存在17kD-hGH，而是由于蛋白酶水解22kD-hGH而產(chǎn)生的片段而已。

3 生長激素濫用情況及檢測方法現(xiàn)狀

3.1 生長激素的濫用情況

由于hGH具有促進(jìn)蛋白合成作用，此外在預(yù)防和恢復(fù)骨折中也有潛在的作用，自20世紀(jì)80年代至今，rhGH一直被懷疑用于體育運(yùn)動的不正當(dāng)競爭。國際奧委會（IOC）于1992年將其列入禁用清單[13]，世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（WADA）也在1999年將其列入禁用清單[14]。

2010年2月，英國反興奮劑機(jī)構(gòu)查出了世界上第1例違規(guī)使用rhGH的檢測陽性，使用者是一名橄欖球運(yùn)動員[15]，截止2011年9月，世界上共有3例生長激素檢測陽性，其中含用藥豁免1例[16]。2000年以來，多次報道與運(yùn)動員攜帶生長激素等有關(guān)的案例。例如:在2000年悉尼奧運(yùn)會期間，一名田徑教練曾試圖攜帶rhGH進(jìn)入澳大利亞[5]；在2002年環(huán)法自行車比賽結(jié)束后，曾在季軍運(yùn)動員妻子的汽車中發(fā)現(xiàn)rhGH[5]；在2004年12月越野滑雪世界杯的比賽中，一名運(yùn)動員在完成興奮劑檢查后將腰包遺落在了興奮劑檢查站，后被發(fā)現(xiàn)其腰包內(nèi)裝有rhGH，國際滑雪聯(lián)合會（FIS）于2005年2月19日決定對相關(guān)運(yùn)動員處以2年禁賽的處罰[17]。

3.2 興奮劑生長激素的檢測

目前，rhGH的檢測方法仍是世界反興奮劑工作的一大難題。內(nèi)源性22kDhGH與外源性hGH氨基酸序列以及結(jié)構(gòu)缺乏差異性，同時hGH的分泌呈脈沖式，與年齡、運(yùn)動、性別、睡眠、飲食均有關(guān)且代謝速率快，導(dǎo)致無法將臨床直接測定hGH濃度的方法用于鑒別興奮劑生長激素。目前，研究較為透徹、完整的rhGH興奮劑檢測方法分為兩大類，分別為rhGH直接檢測法和rhGH間接檢測法[5]。

3.2.1 rhGH直接檢測法

垂體分泌的內(nèi)源性hGH包括了多種亞型，而商業(yè)生產(chǎn)的rhGH僅有22kD-hGH一種形式。雖然人體內(nèi)由于年齡、性別、睡眠、飲食、運(yùn)動等多種因素，hGH濃度相差較大，但是各種hGH亞型之間的比例是恒定的。外源性使用rhGH后，由于內(nèi)分泌系統(tǒng)的負(fù)反饋抑制作用，會迅速抑制人體內(nèi)源性hGH的分泌，從而導(dǎo)致22kD-hGH與非22kD-hGH比例大幅升高。因此，22kD-hGH亞型與非22kD-hGH的比值可作為rhGH使用的檢測依據(jù)。

研究人員利用免疫學(xué)技術(shù)，分別得到了22kD-hGH的單克隆抗體以及非22kD-hGH的單克隆抗體[18]。通過ELISA技術(shù)，利用單克隆抗體即可分別測定22kD-hGH的濃度和非22kD-hGH的濃度，然后計算比值。在研究中，rhGH使用組的數(shù)據(jù)與未使用組的數(shù)據(jù)很好地區(qū)分開，并且在兩種之間沒有交叉重疊出現(xiàn)[19]。

在原有的相同抗體的基礎(chǔ)上，96孔時間分辨熒光免疫測定試劑盒（TRFIA）在2004年雅典奧運(yùn)會以及2006年都靈冬奧會的興奮劑檢測中進(jìn)行了評估。世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（WADA）制定的《世界反興奮劑條例》及《實(shí)驗(yàn)室國際標(biāo)準(zhǔn)》中要求，確證任何的陽性結(jié)果均需要一個獨(dú)立的試驗(yàn)。對于免疫學(xué)試驗(yàn)來說，“獨(dú)立的試驗(yàn)”意味著要有獨(dú)立的表面抗原決定簇的抗體。為此，在原有抗體的基礎(chǔ)上，又得到了另外一對與原抗體識別位點(diǎn)不同的單克隆抗體，從而形成了對rhGH及垂體分泌hGH（phGH）擁有不同識別位點(diǎn)的兩對ELISA化學(xué)發(fā)光試劑盒recA與pitA以及recB與pitB，利用發(fā)光免疫分析技術(shù)（ILMA）進(jìn)行檢測。這些以包被管為載體的試劑盒通過一些WADA認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)室比對和方法驗(yàn)證，得到了WADA的認(rèn)可。目前，該試劑盒被德國柏林的一家公司生產(chǎn)，命名為“GNZ-Zssay GmbH”，作為WADA公認(rèn)的rhGH檢測試劑盒，并已在2008年北京奧運(yùn)會、2010年溫哥華冬奧會等重大賽事中及目前的rhGH的賽外檢查中使用[5]。

3.2.2 rhGH間接檢測法

rhGH直接檢測法檢測窗口期較短，因此，研究對rhGH產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)（產(chǎn)物）的檢測方法——間接檢測法，具有重要的實(shí)用價值。間接檢測法與直接檢測法相比，增加了rhGH使用后可檢出時間。rhGH注射后會導(dǎo)致血液中多種生物指標(biāo)發(fā)生變化，這些指標(biāo)比hGH更加穩(wěn)定，在人體內(nèi)也有更長的半衰期[19]，同時也不會因?yàn)檫\(yùn)動、禁食等狀態(tài)顯著變化[1]。間接檢測法就是在此基礎(chǔ)上建立的，通過檢測體內(nèi)其他與hGH相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)判定rhGH使用的檢測方法。

hGH發(fā)揮其蛋白同化等生理作用主要是由IGF-Ⅰ介導(dǎo)完成的。IGF-Ⅰ在血液中與IGF結(jié)合蛋白（IGFBPs）結(jié)合，完成轉(zhuǎn)運(yùn)。hGH分泌同時還會影響膠原蛋白及骨代謝，這些作用主要通過從骨組織及軟組織中釋放入血的蛋白質(zhì)中反映出來，例如P-Ⅲ-P等。這些由hGH變化受到影響的蛋白中，有的非常穩(wěn)定，經(jīng)常維持在基本值上，同時在運(yùn)動期間也表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性。但同時，這些物質(zhì)的代謝物在尿中含量過低或不穩(wěn)定，不能用于興奮劑檢測。

為了研究rhGH的檢測方法，WADA建立了GH2000計劃，通過評估血清中不同的生物學(xué)指標(biāo)來檢測rhGH的濫用。選取了對使用rhGH敏感但對運(yùn)動不敏感，且較穩(wěn)定的生物學(xué)指標(biāo):IGF-Ⅰ和P-Ⅲ-P，并建立了rhGH使用的判定公式:

男性指標(biāo) = –6.586+2.905×ln（P-Ⅲ -P）+2.100× ln （IGF1）–101.737/age

女性指標(biāo) = –8.459+2.454×ln（P-Ⅲ -P）+2.195× ln （IGF1）–73.666/age

由于GH2000項目中的受試者均為高加索人種，為了驗(yàn)證其在其他人種間的平行性，WADA建立了GH2004計劃，評估印度、中東、非洲及中國人群的數(shù)據(jù)。試驗(yàn)證明，上述公式在其他人群中與高加索人基本一致。但是在GH2004項目中，發(fā)現(xiàn)P-Ⅲ-P指標(biāo)與傷病有一定的相關(guān)性，受傷后P-Ⅲ-P濃度會增加20%，并維持2～3周[25]。

其他研究表明，健康男性急性注射rhGH后，IGF-Ⅰ和IGFBP-3濃度會持續(xù)升高至少1天，同時IGFBP-2濃度下降，IGF-Ⅰ/IGFBP-2與IGF-Ⅰ/IGFBP-3的比例可以考慮發(fā)展作為運(yùn)動員rhGH使用的檢測指標(biāo)。

4 直接檢測法的進(jìn)一步優(yōu)化

目前，直接檢測法作為WADA公認(rèn)的rhGH檢測方法已開始使用，但是從檢測結(jié)果來看，目前世界上僅有3例生長激素實(shí)驗(yàn)室檢測陽性，其中包含1例申報治療用藥豁免（TUE）。

直接檢測法雖然能夠明確地鑒別出使用rhGH的樣本，但是由于22kD/非22kD比值在注射rhGH后不久就能恢復(fù)正常，窗口期非常短，很難對運(yùn)動員實(shí)施有效監(jiān)控。此外，非22kD-hGH種類繁多，針對所有非22kD-hGH產(chǎn)生的單克隆抗體，其穩(wěn)定性、特異性以及干擾因素都很難準(zhǔn)確評估。間接檢測法與直接檢測法相比，雖然具有較長的窗口期，能夠檢測相關(guān)指標(biāo)在停藥后較長時間的異常變化，但是間接指標(biāo)仍有待于世界反興奮劑機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。顯然，直接檢測方法的有效性仍有待提高。

目前，針對直接檢測法的研究仍在繼續(xù)和深入，內(nèi)容涉及建立基礎(chǔ)方法、優(yōu)化下游實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及優(yōu)化判定依據(jù)三方面。

4.1 直接檢測法的基礎(chǔ)研究

目前直接檢測法的檢測依據(jù)是檢測22kD-hGH與非22kD-hGH的比值，而非22kD-hGH包括多種不同亞型的hGH。因此其單克隆抗體的穩(wěn)定性、特異性以及干擾因素都很復(fù)雜，不如單一蛋白質(zhì)所得到的單抗穩(wěn)定。目前直接檢測法的研究主要是建立以非22kD-hGH中單一亞基為檢測指標(biāo)的檢測方法。

針對目前的試劑盒,WADA資助各國實(shí)驗(yàn)室開展關(guān)于20k-DhGH單克隆抗體的研究，試圖考慮將22kD與20kD-hGH濃度的比例作為興奮劑檢測的指標(biāo)。Wallace等對17名年齡（26.9±1.5）歲、具備有氧訓(xùn)練史的健康男性，進(jìn)行了隨機(jī)重復(fù)的靜止抗阻力訓(xùn)練。訓(xùn)練構(gòu)成為20分鐘不間斷蹬功率自行車，達(dá)到80%最大攝氧量。研究結(jié)果顯示，體內(nèi)hGH所有亞型的濃度均上升，運(yùn)動結(jié)束后達(dá)到峰值，在運(yùn)動過程中，22kD始終是體內(nèi)hGH的主要形式；運(yùn)動后非22kD亞型的比例升高，這可能與20kD清除較慢或其他非22kD亞型導(dǎo)致。不同亞型hGH的多樣的生物學(xué)作用是否會影響運(yùn)動后的hGH動態(tài)平衡，仍然是一個有待討論的問題[20]。另有研究表明，正常生理狀態(tài)下以及其他藥物作用下，22kD與20kD hGH亞型的比例是恒定不變的，其比例變化與外源性rhGH的使用高度相關(guān)[21]。20kD的比例不受年齡、性別、青春期、體重指數(shù)（BMI）以及hGH分泌量的影響，相對固定，相同的結(jié)論在其他研究人員的研究中也有報道[20]。由此得出，可以將20kD與22kD的比值作為判定外源性使用rhGH的有效指標(biāo)。

目前，中國反興奮劑中心檢測實(shí)驗(yàn)室等5個實(shí)驗(yàn)室都分別得到了20kD-hGH的單克隆抗體。其中我國實(shí)驗(yàn)室與日本實(shí)驗(yàn)室Toshio Tsushima得到的單克隆抗體穩(wěn)定性好，且與其他亞型hGH的交叉性較低[22]。但目前，各實(shí)驗(yàn)室均未制成能提供市售的20kD-hGH檢測試劑盒。

4.2 優(yōu)化下游實(shí)驗(yàn)技術(shù)的研究

為了使目前的rhGH檢測方法以及正在研究中的20kD-hGH/22kD-hGH的檢測方法更有效地檢測rhGH的濫用情況，檢測技術(shù)的優(yōu)化也是檢測方法研究的重要部分，其主要目的是建立穩(wěn)定的材料及數(shù)據(jù)來源，并提高實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性、可重復(fù)性及靈敏性。為了達(dá)到這個目的，目前的優(yōu)化方式主要包括:1、將檢測抗體更換為純化的山羊體內(nèi)分泌的抗人GH抗體；2、利用生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)（biotin-avidin complex）調(diào)整檢測條件，從而達(dá)到放大信號的作用[23]。

此外，針對hGH直接檢測法，目前還有一項正在開展的研究，即以ELISA為工作原理，利用流式細(xì)胞技術(shù)開展hGH亞型濃度的測定。該技術(shù)將抗體固化在聚苯乙烯微光束上并用特定的熒光標(biāo)記，最后通過流式細(xì)胞儀分別篩選不同類別的亞型并測定濃度。該方法將大幅提高檢測靈敏度，將檢測級別提高至 pg/ml[23]。

4.3 優(yōu)化判定依據(jù)的研究

關(guān)于rhGH直接檢測法的檢測陽性判定依據(jù)，WADA也在根據(jù)數(shù)據(jù)的積累逐步調(diào)整。2010年，“rhGH檢測方法指南”發(fā)布前，男子與女子的判定限差別較大，女子的判定限低于男子，具體判定限見表1。2010年6月，“rhGH檢測方法指南”發(fā)布后，根據(jù)近幾年的數(shù)據(jù)，對原有的判定限進(jìn)行了調(diào)整。提高了kit1的判定限，降低了kit2的判定限，同時男女之間的差別縮小。

關(guān)于判定依據(jù)的研究，我國興奮劑檢測實(shí)驗(yàn)室針對中國人群挑選了25名年輕男性開展了rhGH受試研究，受試劑量為0.1IU/kg/d。依據(jù)目前的判定限，單次注射rhGH后，檢測窗口平均在12至18小時之間，最長的為21小時，最短的檢測窗口僅為6小時，低于Bidlingmaier等得出的32小時[18]。根據(jù)WADA實(shí)驗(yàn)室技術(shù)文件TD2010DL，我國興奮劑檢測實(shí)驗(yàn)室依據(jù)自2008年以來近3年的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，推算出了更適于中國人群的判定限應(yīng)在1.5左右。與受試項目的檢測數(shù)據(jù)比對，該數(shù)據(jù)能夠延長檢測窗口[24]。

表1 rhGH判定依據(jù)比對

5 展望

作為目前WADA唯一認(rèn)可使用的rhGH檢測方法，雖然hGH直接檢測法的窗口期很短，但是作為事先無通知的賽外檢查，直接檢測法仍然是一種有效的rhGH濫用的檢測方法，其穩(wěn)定性高，不會受到運(yùn)動、年齡、飲食等身體狀態(tài)的影響。22kD-hGH與20kD-hGH的比例測定將因其亞型的單一性及穩(wěn)定性，成為直接檢測法的發(fā)展趨勢。

同時，在發(fā)展直接檢測法的同時，針對檢測窗口短的缺陷，生長激素檢測方法的研究還應(yīng)致力于穩(wěn)定性高且檢測窗口長的檢測方法。例如:間接指標(biāo)檢測法、白細(xì)胞基因表達(dá)等。

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