脂易消對NAFLD大鼠肝組織ChREBP mRNA表達(dá)的影響*

周岳君 陳玉翠

脂易消對NAFLD大鼠肝組織ChREBP mRNA表達(dá)的影響*

周岳君①陳玉翠②

目的：觀察脂易消對實驗性非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝組織碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ChREBP)mRNA表達(dá)的影響。方法：采用高脂飲食制備NAFLD大鼠模型，分低、中、高劑量脂易消治療組、易善復(fù)膠囊陽性對照組、模型對照組、正常對照組。顯微鏡下觀察HE染色后各組肝細(xì)胞脂肪變性及肝組織炎性改變情況；使用RT-PCR法檢測各組大鼠肝組織ChREBP mRNA的水平。結(jié)果：實驗結(jié)束時模型組體重指數(shù)(BMI)明顯增高，與正常組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而與模型組相比，脂易消各劑量組及易善復(fù)組肝指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但高、中、低劑量組與易善復(fù)組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。光鏡觀察顯示正常對照組沒有發(fā)生脂肪變性及炎性浸潤；模型組總體肝組織脂肪變性程度與正常組肝組織相比有顯著的差異。脂易消組肝組織發(fā)生彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性及輕微的炎性浸潤，程度輕于模型組。易善復(fù)組肝組織炎性改變程度與脂易消組比較沒有明顯的差異。結(jié)論：脂易消能改善肝細(xì)胞脂肪性變及肝組織炎性病變，提高肝組織ChREBP mRNA表達(dá)水平，對高脂飲食引起的NAFLD有治療作用，具有與易善復(fù)相似的療效。

脂易消； NAFLD； 大鼠； ChREBP mRNA

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)主要與代謝異常、環(huán)境因素及遺傳等因素相關(guān)，是以肝細(xì)胞脂肪變性為主要病理改變的臨床綜合征。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是其病理變化的重要階段[1-2]，發(fā)病率逐年增高[3]，研究表明其是隱源性肝硬化的重要病因[4-5]，甚至可發(fā)展為肝癌[6-7]。祖國醫(yī)學(xué)把本病列入“脅痛”、“痰濕”、“積聚”等范疇，認(rèn)為本病多因過食膏梁厚味或煙酒炙煿之品，脾胃受損，痰濁內(nèi)生，濕毒郁滯；或情志郁結(jié)，肝失疏泄，或病后失調(diào)，氣機阻滯，氣滯血瘀所致。筆者認(rèn)為濕毒痰瘀是本病的主要病機。

脂易消為筆者長期臨床實踐中總結(jié)出來的治療脂肪肝的有效方藥，經(jīng)長期臨床觀察和前期課題證實療效確切[8-11]。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)大鼠非酒精性脂肪性肝炎模型，通過低、中、高各劑量組脂易消對其進行干預(yù)，易善復(fù)膠囊作為陽性對照藥物。經(jīng)藥物干預(yù)后觀察各實驗組大鼠肝臟組織病理學(xué)改變，同時運用RT-PCR技術(shù)檢測肝組織中ChREBP mRNA的表達(dá)水平，探討脂易消治療非酒精性脂肪性肝炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠60只，雄性，體重(180±20)g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，分籠喂養(yǎng)，自由飲水和進食，室溫(20±2)℃，濕度50%，明暗分別處理12 h，預(yù)養(yǎng)1周后進入實驗階段。

1.1.2 方藥及制備 脂易消主要由丹參、半夏、荷葉、枳殼等中藥組成，藥物由杭州市方回春堂提供，再經(jīng)浙江省中醫(yī)院制劑室加工而成。易善復(fù)(多烯磷脂酰膽堿)由北京萬安特制藥有限公司提供，生產(chǎn)批號：20091110，生理鹽水由浙江省新昌制藥廠提供，生產(chǎn)批號：090803。

1.1.3 儀器 AP280-1冷臺、HM335E切片機、AllegraTM 64R高速冷凍離心機，Nikon eclipse 80i光學(xué)顯微鏡，ATL-031型智控恒溫?fù)u床，PYX-DHS-35×40型Techne PCR儀、AP280-2型包埋機、1200系列高效液相色譜儀。

1.1.4 試劑 Oligod(T)18試劑、TaqTM試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(大連寶生物工程有限公司)；TRIzol(US Invitrogen公司)；PCR Marker、PCR引物合成(上海生物工程有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物造模 動物造模采用陳芝蕓[12]課題組NAFLD模型方法，雄性SD大鼠，體重(180±20)g，用高脂飼料(10%豬油、5%蛋黃粉、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉及82.5%基礎(chǔ)飼料)持續(xù)飼養(yǎng)12周，大鼠產(chǎn)生重度大泡性脂肪變，小葉內(nèi)炎性表現(xiàn)明顯，點狀或小灶性壞死，匯管區(qū)炎性程度較小葉內(nèi)輕，血清轉(zhuǎn)氨酶增高，NAFLD模型建立。

1.2.2 分組與用藥 60只清潔級SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分成模型組(下文簡稱B組)，高、中、低劑量(脂易消)組(下文分別簡稱C、D、E組)，易善復(fù)組(下文簡稱F組)，正常對照組(下文簡稱A組)，每組10只。其中A組喂食普通飼料，不予任何處理；B、C、D、E、F組均喂食高脂飼料。其中C、D、E組給予中藥干預(yù)，每天經(jīng)口灌服高、中、低劑量(分別為成人劑量的12倍/kg、6倍/kg、3倍/kg)脂易消；F組每天經(jīng)口灌服中劑量易善復(fù)(成人劑量的6倍/kg)；B組僅喂食高脂飼料，每天經(jīng)口灌服等劑量的生理鹽水。實驗期間，實驗動物自由飲水與進食，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，(20±2)℃明暗各12 h，造模12周后處死動物。

1.2.3 制備標(biāo)本 最后一次用藥后，當(dāng)晚禁食12 h，不用禁水，第2天上午用3%戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉(按1 ml/kg的劑量空腹給予)，從大鼠的下腔靜脈抽血，用離心機把血清分離，放進冰箱保存?zhèn)溆?，冰箱溫度要控制?20 ℃；同時把大鼠肝組織取出，稱取其重量，于肝右葉中部選取數(shù)塊肝組織置于液氮中備取總RNA，還要取肝右葉組織石蠟包埋，用于病理檢查。

1.3 檢測方法

1.3.1 肝組織病理學(xué)檢測 取大鼠肝臟右葉肝組織，立即用10%中性磷酸緩沖液(phosphate buffer solution，PBS，pH=7.0，以下同)福爾馬林液中固定，固定過夜后，按1 cm×1 cm×0.2 cm大小取材，標(biāo)記后流水沖洗30 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明后浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，HE染色，觀察肝組織炎性改變及細(xì)胞變性情況。

非酒精性脂肪性肝病病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《非酒精性脂肪性肝炎診斷指南》[13]實施：依據(jù)肝細(xì)胞脂肪變性占據(jù)所獲取肝組織標(biāo)本量的范圍，分為4度(F0-4)：F0：肝細(xì)胞內(nèi)無脂滴沉積；F1：肝小葉內(nèi)<30%的肝細(xì)胞有脂肪變；F2：肝小葉內(nèi)30%~50%的肝細(xì)胞有脂肪變；F3：肝小葉內(nèi)50%-75%的肝細(xì)胞有脂肪變；F4：75%以上的肝細(xì)胞有脂肪變。

1.3.2 RT-PCR檢測ChREBP mRNA表達(dá)

1.3.2.1 提取總RNA 把肝組織(300 mg)從-70 ℃冰箱中取出，混合液氮后將其磨成粉末，再混合l2 ml的Trizo研磨，磨好后置入無RNA酶、DNA酶的1.5 ml離心管中。再與0.2 ml氯仿相混合，高強度振蕩30 s，混勻后，常溫下離心12 000 r/min，持續(xù)5 min；取上層溶液置入另一新潔凈1.5 ml離心管中，混合等容積的異丙醇，振蕩混勻，常溫下放置5 min，在常溫下再進行離心12000 r/min，持續(xù)5 min，去掉上清液，再混合70%乙醇1 ml洗凈并烘干，用0.05 ml DEPC去離子水再次溶解RNA。提取出的總RNA經(jīng)紫外線分光光度計檢測提取物濃度，A260與A280之比在1.8~2.0范圍之內(nèi)。

1.3.2.2 相關(guān)引物合成 依據(jù)Primer premier 5.0設(shè)計引物，同時還要參照核苷酸排列，由上海生物工程有限公司進行相關(guān)引物的合成。ChREBP mRNA引物排列：ChREBP上游引物：5’-AGG GAG ACG CAG GTGT-3’；下游引物：5’-CTG ATA CTG GTC GTA GGT GA-3’，擴增片段為368bp。內(nèi)參照β-actin上游引物：5’-ATG CCA TCC TGC GTC TG-3’；下游引物：5’-ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACAT-3’，擴增片段為578bp。

1.3.2.3 逆轉(zhuǎn)錄操作 取提取好的總RNA，準(zhǔn)備5μl 5×Buffer，10pmol oligd(dT)，4μl dNTP(2.5 mM)，1μl RNA酶抑制劑，5 U M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，加入DEPC水至25 μl，輕輕混勻，常溫下停放10 min，再置入42 ℃恒溫器內(nèi)，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，要保持1 h的42 ℃恒溫。反應(yīng)完畢在冷水中降溫2 min，降溫后的反應(yīng)液就能用作PCR反應(yīng)中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。

1.3.2.4 PCR反應(yīng)操作 把逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物置入50 μl的反應(yīng)體中進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體包含5 μl 10×Reaction Buffer、四種2 μl dNTP的混合物(每一種2.5 mM)、3 U/μl TaqDNA多聚酶、3 μl 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、1 μl上下游引物、35 μl去離子水。設(shè)定溫度94 ℃使其預(yù)變性5 min，再依據(jù)以下要求重復(fù)30次，94 ℃變性，持續(xù) 30 s、55 ℃退火處理 30 s，72 ℃延伸處理 30 s，最后72 ℃延伸，持續(xù)5 min。

1.3.2.5 PCR產(chǎn)物檢測 用1%的瓊脂糖(含溴化乙錠溶液0.5μ g/ml)把5 μl的PCR反應(yīng)物凝膠電泳2 h，再選用3 μl Marker當(dāng)作PCR產(chǎn)物DNA片段體積的參照物。凝膠電泳完畢，用天能圖像分析系統(tǒng)進行檢測，用BandScan加以處理，測出產(chǎn)物條帶的吸光度，以β-actin為標(biāo)準(zhǔn)，進行半定量研究，其中ChREBP mRNA的相對表達(dá)水平以ChREBP/β-actin來表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)加以處理，計量資料以(±s)的形式表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用字檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 在實驗過程中，C組1只大鼠死亡。A組大鼠飲食正常，發(fā)育良好，活潑好動；而高脂飼料飼養(yǎng)的各組大鼠體毛逐漸稀疏，性情較溫順，不喜動。實驗結(jié)束時B組體重指數(shù)(BMI)明顯增高，與A組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而與B組相比，C、D、E組及F組肝指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但C、D、E組與F組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 六組大鼠BMI的變化(±s)

表1 六組大鼠BMI的變化(±s)

*與A組比較，P<0.01；△P<0.05，#P<0.01，與B組比較；*△與F組比較，P>0.05

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2.2 大鼠肝組織HE染色后光鏡觀察結(jié)果 (1)A組：大部分肝細(xì)胞為單核，肝小葉結(jié)構(gòu)光鏡下顯示清晰，肝板顯示出條索結(jié)構(gòu)，呈放射狀排列，且包繞著中央靜脈，沒有發(fā)生脂肪變性及炎性浸潤。(2)B組：光鏡顯示肝細(xì)胞腫脹，胞漿松散，產(chǎn)生大量脂肪空泡，出現(xiàn)彌漫性的肝細(xì)胞脂肪變性。炎性細(xì)胞浸潤發(fā)生在匯管區(qū)和小葉間，破壞了正常的肝小葉，有的大鼠肝小葉內(nèi)成片壞死并融合，沒有肝纖維化表現(xiàn)；總體肝組織脂肪變性程度與正常肝組織相比有顯著的差異。(3)C、D、E組：肝組織鏡下顯示出彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性，程度輕于B組。匯管區(qū)及小葉間發(fā)生輕微的炎性細(xì)胞浸潤，其程度也輕于模B組。(4)F組：該組的肝組織炎性改變程度與C、D、E組比較沒有明顯的差異。六組大鼠肝組織脂肪變性情況比較見表2，六組大鼠肝組織炎性浸潤情況比較見表3。

表2 六組大鼠肝組織脂肪變性程度比較 只

表3 六組大鼠肝組織炎性浸潤情況比較 只

2.3 肝組織ChREBP mRNA表達(dá)水平檢測 B組大鼠肝組織ChREBP mRNA表達(dá)水平較A組顯著升高(P<0.01)；C、D、E組和F組顯著低于B組(P<0.01)；E組與A組相比無明顯差異(P>0.05)；D、E組大鼠肝組織ChREBP mRNA表達(dá)水平與F組相比無明顯差異(P>0.05)。見表4。

表4 六組大鼠ChREBP mRNA表達(dá)水平(±s)

表4 六組大鼠ChREBP mRNA表達(dá)水平(±s)

*P<0.01，△P>0.05，與A組比較；#與B組比較，P<0.01；*△與F組比較，P>0.05

組別 只數(shù)(只) ChREBP mRNA A組 10 0.7007±0.0364 B組 10 0.7770±0.0396*E 組 10 0.7067±0.0397△#D 組 10 0.6490±0.0420#*△C 組 9 0.6227±0.0368#*△F 組 10 0.5945±0.0301#

3 討論

評價NAFLD療效的金標(biāo)準(zhǔn)是肝臟組織病理學(xué)檢查。實驗發(fā)現(xiàn)，A組大鼠肝組織無明顯異常，B組大鼠肝組織可見彌漫性肝細(xì)胞脂肪變，程度均為重度，伴小葉內(nèi)炎癥及匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤，部分大鼠小葉內(nèi)壞死灶融合成片，但未見肝纖維化形成。C、D、E組大鼠肝組織也見不同程度脂肪變性，與B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；肝組織的炎癥分布和性質(zhì)與B組相似，但程度明顯減輕；其炎癥活動度較B組顯著下降(P<0.05)，但仍高于A組(P<0.05)；與F組相似(P>0.05)，結(jié)果顯示B組大鼠脂肪變性處F3級，結(jié)果符合國內(nèi)多數(shù)文獻(xiàn)的報道；C、D、E組能明顯改善肝組織炎癥活動度，與F組相似(P>0.05)，說明脂易消能減輕NAFLD大鼠炎性反應(yīng)。

研究結(jié)果顯示，與A組相比，B組ChREBP mRNA表達(dá)明顯增高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示高脂飲食誘導(dǎo)時，脂易消可能調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分泌ChREBP，降低肝組織ChREBP表達(dá)水平，從而達(dá)到治療NAFLD的作用。本實驗實驗提示，脂易消可減輕肝組織炎癥損傷，具有治療作用，療效與易善復(fù)相似；能顯著降低NAFLD大鼠肝組織ChREBP mRNA表達(dá)水平，提示其治療非酒精性脂肪性肝炎作用機理可能與其調(diào)節(jié)ChREBP mRNA在肝臟的表達(dá)有關(guān)。

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The Influence of Zhiyixiao to Eliminate NAFLD Rat Liver Tissue ChREBP mRNA Expression

ZHOU Yue-jun，CHEN Yu-cui.

Objective:To observe the influence of Zhiyixiao on experimental nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) rat liver tissue carbohydrate response element binding protein (ChREBP ) on the expression of mRNA.Method:Given high fat diet to NAFLD rat model，divided them into low，medium， high Zhiyixiao treated group，Yishanfu capsule in the positive control group，saline control group，normal control group.Microscopically observed by HE staining in all groups after fatty degeneration of liver cells and the liver tissue inflammatory changes;the use of RT-PCR was detected by rat liver tissue ChREBP levels of mRNA.Result:At the end of the experiment in model group，body mass index (BMI) were significantly increased，compared with the normal group the differences were statistically significant (P<0.01);and compared with the model group，the index of all Zhiyixiao groups and Yishanfu group decreased significantly (P<0.05);but the high，medium，low treated groups and Yishanfu group there were no significant differences(P>0.05).The light microscope showed that the normal group had no fatty degeneration and inflammatory infiltration;group model overall liver fatty degeneration degree compared with that in normal liver tissues had significant difference.Conclusion:Zhiyixiao can improve liver steatosis and liver tissue inflammatory diseases， improve liver tissue ChREBP expression level of mRNA，on high fat diet induced by NAFLD treatment，and Yishanfu has similar efficacy.

Zhiyixiao； NAFLD； Rat； ChREBP mRNA

The Chinese Medicine University of Zhejiang，Hangzhou 310053，China

Medical Innovation of China，2012，9(22):001-004

10.3969/j.issn.1674-4985.2012.22.001

浙江省科技廳資助課題(編號：2009C33161)

①浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

②山東醫(yī)藥技師學(xué)院

周岳君

2012-06-01) (本文編輯：連勝利)