生姜醇提取物誘導TM4細胞凋亡的研究＊

王慶忠

（1.山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室，山東 濰坊 261061；2.濰坊學院，山東 濰坊 261061）

生姜（Zingiber officinale）是藥食同源植物，具有驅(qū)風散寒、健胃止吐、抑菌殺蟲、抗腫瘤等作用。生姜醇提取物（Zingiber officinale extraction in alcohol，CCM）含姜黃素等多種物質(zhì)，其中的姜黃素為姜的重要活性成分之一，廣泛用于食品添加劑和著色劑，具有抗HIV、抗利什曼原蟲、抗細胞畸變、抑制血小板聚集和血栓形成等多種作用[1-2]。尤其是生姜醇提取物的抗癌活性在近年來受到廣泛重視。研究表明，生姜醇提取物可誘導細胞凋亡，對宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、乳腺癌等各種癌癥的發(fā)生有抑制和治療作用[3-11]。但關(guān)于生姜醇提取物對精子發(fā)生和睪丸腫瘤的作用，至今未見報道。TM4細胞株來源于小鼠睪丸支持細胞（Sertoli cells），在體外培養(yǎng)中具有支持細胞、上皮細胞和腫瘤細胞的特性。通過研究生姜醇提取物對TM4細胞的影響，可反映其對哺乳動物和人的生精作用和睪丸腫瘤發(fā)生的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

L-谷胺酰胺、青霉素、鏈霉素、葡萄糖、二甲基亞楓（DMSO）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM、胰蛋白酶（Trypsin）、明膠、MTT（甲基四氫葉酸鹽）等試劑均購于Sigma-Aldrich公司；TUNNEL細胞凋亡檢測試劑盒為凱基生物有限公司產(chǎn)品；其它一般試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器包括細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶（北京鼎國生物有限公司）、CO2培養(yǎng)箱（美國Precision Scientific Inc.）、倒置顯微鏡（日本Olympus）、An Thos TH2酶標儀（Austria公司）等。

1.2 細胞株與培養(yǎng)條件

小鼠支持細胞系TM4細胞株由中國科學院動物研究所生殖生物學重點實驗室惠贈。

細胞培養(yǎng)基是以DMEM為基本培養(yǎng)液，添加2mM L-谷氨酰胺、5%FBS、100unit／ml青霉素和100ug／ml鏈霉素。細胞培養(yǎng)在37°C、5%CO2和飽和濕度條件下。0.25%的胰蛋白酶消化傳代。細胞單層貼壁生長，選擇對數(shù)生長期細胞進行試驗。將TM4細胞株分為對照組和實驗組。實驗組以5種不同濃度的生姜醇提取物進行處理。

1.3 生姜醇提取物的制備

將2000g生姜粉碎后，加入60%的乙醇500ml，置入65℃恒溫水浴中，作用12小時。然后過濾，棄去殘渣，浸提液置于65℃干燥箱中烘干。稱重浸出物，并配制成0.1mg／ml的母液。

1.4 MTT比色法檢測TM4細胞活性

MTT能被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細胞無此功能。DMSO能溶解甲瓚，用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。

用0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的TM4細胞，制成5×104cell／mL細胞懸液，以每孔200μL接種于96孔板，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，棄掉培養(yǎng)基，依次以終濃度為20、40、60、80、100μg／mL的生姜醇提取物的培養(yǎng)液分別加入96孔板的各孔內(nèi)，每一濃度設5個平行孔。同時設對照組（不加藥組）及空白組（僅加培養(yǎng)基）。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，每孔加入5g／L的MTT20μL，培養(yǎng)箱中孵育4h，然后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO液200μL，將培養(yǎng)板置于微孔板蕩器上振蕩10min，使結(jié)晶物溶解，最后在酶標儀上于4920nm的波長下測定各孔的吸光度OD值。通過下式計算細胞存活率和抑制率：

細胞存活率＝[（對照組OD值-實驗組OD值）／（對照組OD值勤-空白組OC值）]×100%

抑制率＝100%-存活率

試驗重復3次取平均值。結(jié)果用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件進行t檢驗及數(shù)據(jù)處理，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 原位末端標記法（TUNNEL）檢測TM4細胞凋亡

TM4細胞的處理同上，所不同的是制作成細胞爬片，載玻片常規(guī)干熱滅菌處理，用前以0.2明膠包被10分鐘，然后用PBS洗滌3次后接種細胞。細胞的染色按試劑盒說明書進行，主要步驟如下：

①取出細胞爬片，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定20min，PBS洗滌5min×2次；②加入3%過氧化氫室溫下孵育20min，PBS洗滌5min×3次；③0.1蛋白酶K在4℃下作用30min，PBS洗滌5min×3次；④加入反應混合液，37℃濕盒內(nèi)孵育60min，PBS洗滌5min×3次，然后加50μLPOD，繼續(xù)孵育60min，PBS洗滌5min×3次；⑤加入50μL新配制的DAB顯色試劑，作用3-5min，自來水洗，置鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下觀察到生姜醇提取物對TM4細胞的增殖有抑制作用

光鏡下，對照組的TM4細胞呈上皮樣貼壁生長良好，形態(tài)呈梭形或多角形，胞核明顯。20μg／mL的生姜醇提取物處理組的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有明顯變化；40μg／mL的醇提取物處理組可觀察到細胞生長不良，某些細胞的胞體變小，變圓，貼壁細胞數(shù)目減少；60μg／mL的醇提取物處理組中可觀察到大量的細胞脫壁，輪廓不清，細胞膜破潰，聚集成細胞團，以及少量的細胞碎片。因此，隨處理劑量的增加，生姜醇提取物明顯抑制TM4細胞的生長與增殖（見圖1）。

圖1 光鏡下生姜醇提取物對TM4細胞的影響（×260）

2.2 MTT法檢測出生姜醇提取物對TM4細胞的增殖有抑制作用

MTT法測定的不同濃度的熟地黃醇提取物對TM4細胞株生長與增殖的影響見表1。從表中各不同濃度的生姜醇提取物對細胞的抑制率可以看出，20μM／mL生姜醇提取物處理的TM4細胞與對照組比較沒有顯著差異，40μg／mL生姜醇提取物處理組對TM4細胞增殖的抑制作用與對照組比較已經(jīng)有較明顯的差異，隨著處理濃度的增大，這種抑制作用越來越強，呈劑量間依賴性。處理濃度達到100μg／mL時，TM4細胞的生長與增殖已被基本抑制。

表1 MTT法檢測各濃度生姜醇提取物對TM4細胞增殖的影響±S）

表1 MTT法檢測各濃度生姜醇提取物對TM4細胞增殖的影響±S）

注：與對照組比較，＊P＜0.05。

組別 對照組 CCM 處理組劑量（μΜ／mL）0.0 20 40 60 80 100抑制率 1.29±0.03 3.84±0.24 21.2±0.2＊ 37.7±0.1＊ 51.2±0.1＊ 74.6±0.11＊

2.3 TUNNEL法檢測到生姜醇提取物誘導TM4細胞凋亡

通過試驗檢測發(fā)現(xiàn)，CCM具有誘導TM4細胞凋亡的作用。在20μM／mL生姜醇提取物處理組檢測載片上，偶見凋亡的細胞，說明這一濃度的生姜醇提取物處理對TM4細胞沒有影響；40μM／mL生姜醇提取物處理組的載片上可觀察到較多的凋亡細胞，隨著處理濃度的增加，凋亡細胞的比例逐漸增大（見圖2，其它處理組的圖片未展示）。凋亡細胞統(tǒng)計與分析也表明，40μM／mL生姜醇提取物處理組與對照組比較有顯著差異（見表2）。

圖2 光鏡下觀察的生姜醇提取物對TM4細胞的影響（TUNNEL法）

表2 不同濃度的生姜醇提取物對TM4細胞的凋亡指數(shù)±S，n＝3）

表2 不同濃度的生姜醇提取物對TM4細胞的凋亡指數(shù)±S，n＝3）

注：與對照組比較，＊P＜0.05。

生姜醇提取物處理濃度（μg／mL） TM4細胞凋亡指數(shù)（﹪）對照組1.87 20 5.01 40 28.01＊60 37.30＊80 56.63＊100 73.08＊＊

3 結(jié)論與討論

生姜醇提取物具有多方面的藥理作用。尤其是作為一種具有良好發(fā)展前景的抗癌新藥，具有抗癌譜廣、毒副作用小的優(yōu)點，被認為是一種潛在的第3代抗惡性細胞增殖藥[4-11]。許多研究表明，生姜醇提取物具有確切的抗細胞增殖活性[2，8]。但生姜醇提取物對睪丸中支持細胞和生精細胞的影響作用還未見報道。

在本研究中，利用小鼠睪丸支持細胞株TM4作為研究材料，通過光鏡下的細胞形態(tài)觀察、MTT法測定細胞活性和TUNNEL法三種方法研究生姜醇提取物對TM4細胞的影響。研究結(jié)果表明，生姜醇提取物抑制TM4細胞的增殖，誘導TM4細胞凋亡。這一結(jié)果與報道的生姜醇提取物對其它類型的細胞的影響是一致的，40μM／mL的生姜醇提取物即能顯著抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡[2-8]，并呈劑量依賴效應。TM4細胞來源于小鼠的睪丸支持細胞，既具有支持細胞的特殊性，又具有腫瘤細胞的特點。我們這一研究的結(jié)果也表明，生姜醇提取物對睪丸癌細胞的增殖有抑制和誘導其凋亡的作用。因此，生姜醇提取物可以作為預防和治療睪丸癌的一種藥物。但生姜醇提取物誘導睪丸細胞凋亡的詳細機制還有待于進一步的研究。

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