大孔吸附樹脂純化“黑美人”土豆色素研究

張 勇，李彩霞，*，麻貝貝，王興德，王秀梅

(1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000; 2.民樂縣農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)辦公室，甘肅民樂734503)

大孔吸附樹脂純化“黑美人”土豆色素研究

張 勇1，李彩霞1，*，麻貝貝1，王興德2，王秀梅1

(1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000; 2.民樂縣農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)辦公室，甘肅民樂734503)

比較了5種大孔吸附樹脂對(duì)“黑美人”土豆色素的吸附和解吸效果，研究了AB－8樹脂對(duì)“黑美人”土豆色素的靜態(tài)吸附和解吸性能。結(jié)果表明，“黑美人”土豆色素在AB－8樹脂上吸附平衡時(shí)間為8h，解吸平衡時(shí)間為2h，在吸附液pH 3.0、溫度為40℃時(shí)吸附能力最強(qiáng);以pH 3.0的90%的乙醇為洗脫液解吸效果較好。經(jīng)AB－8大孔吸附樹脂純化后的色素色價(jià)比粗品提高了8.4倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AB－8樹脂可用于“黑美人”土豆色素的分離與純化。

“黑美人”土豆色素，大孔吸附樹脂，純化

當(dāng)今社會(huì)，食品安全問題日益引起人們關(guān)注。由于人工色素安全性和副作用的問題，導(dǎo)致其產(chǎn)量大幅下降［1］，而天然食用色素安全可靠，色澤自然，因此尋求和開發(fā)利用天然色素資源愈發(fā)重要［2－3］。花色素廣泛存在于各種植物中，是一類在國(guó)外已得到廣泛應(yīng)用的天然色素。目前國(guó)內(nèi)已開發(fā)出多種以植物資源為原料的花色素，如甘藍(lán)色素、蘿卜色素、紫蘇色素等，它們具有安全性高、資源廣泛等優(yōu)點(diǎn)?！昂诿廊恕蓖炼故怯筛拭C蘭州隴神航天育種研究所采用雜交育種育成的土豆新品種，是一種藥食兼用的特色健康食品［4］。該品種除營(yíng)養(yǎng)豐富外，其富含的花青素還具有抗癌、抗衰老、抗病毒［5］、美容和防治高血壓等多種藥理和保健作用。有望用于食品或其他材料的著色、防腐，具有作為抗氧化劑使用的開發(fā)潛力。大孔吸附樹脂是一類不含交換基團(tuán)的孔狀結(jié)構(gòu)高分子吸附劑，具有吸附容量大、選擇性好、易于解吸、機(jī)械強(qiáng)度高、再生處理速度快等優(yōu)點(diǎn)［6－8］，同其他分離純化工藝相比，可減少有機(jī)溶劑的用量，簡(jiǎn)化生產(chǎn)步驟，降低生產(chǎn)成本。經(jīng)大孔樹脂處理后，可有效地去除粗品中大量的糖類、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)等成分，使色素成分高度富集而提高色素品質(zhì)。用大孔吸附樹脂精制花色素是比較有效的一種方法，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)色素的純化進(jìn)行了大量的研究，Liu xueming等［9］用x－5樹脂對(duì)桑葚紅色素吸附和分離進(jìn)行了研究;張國(guó)銘等［10］對(duì)幾種樹脂分離玫瑰紅色素進(jìn)行了比較;桂克印等［11］對(duì)大孔樹脂純化樟樹果實(shí)紅色素的吸附性能進(jìn)行了研究;趙慧芳等［12］對(duì)幾種樹脂純化黑莓果實(shí)色素進(jìn)行了比較，并取得了良好的效果。然而，目前對(duì)于純化“黑美人”土豆色素的相關(guān)研究報(bào)道較少［13］，尤其對(duì)色素純化方面的研究尚未見報(bào)道。本文比較了5種不同類型的大孔吸附樹脂對(duì)“黑美人”土豆色素粗品的吸附和解吸效果，其目的是篩選出較為適合“黑美人”土豆色素純化的樹脂類型，并對(duì)其吸附和解吸性能進(jìn)行了研究，以期為“黑美人”土豆色素的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“黑美人”土豆 采于張掖市民樂縣新天鋪，塊莖清洗掉塵土，置于冰箱冷凍保存;無水乙醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉等藥品 均為國(guó)產(chǎn)分析純;X－5、AB－8、NKA－9、NKA－Ⅱ、D4020大孔吸附樹脂 天津南開大學(xué)化工廠產(chǎn)品。

SHZ－2000型雙配套循環(huán)水式多用真空泵 河南省鞏義市英峪予華儀器廠;CR21GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日立公司;VA1－2真空干燥箱 美國(guó)Shellab公司;760CRT雙光束紫外可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;電子天平(Mettler Toledo，0.01mg/200g)、XT－5006－BF26超級(jí)恒溫水槽 杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司;pHS－3C型精密pH計(jì)浙江蕭山;層析柱Φ25×30mm 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 “黑美人”土豆色素的提取 “黑美人”土豆→洗凈→打漿機(jī)打碎→浸提(料液比1.0g∶10mL)至材料無色→抽濾→濾液減壓濃縮(壓力0.075MPa，溫度30～40℃)→濃縮液冷凍過夜→低溫離心10min(10000r/min)→收集色素液→乙醚洗滌多次→真空干燥→色素粘稠液冷凍備用。

1.2.2 “黑美人”土豆色素的吸收光譜 精確稱取0.1g“黑美人”土豆色素粘稠液，分別用pH 3.0的酸性乙醇溶液和pH 3.0的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液溶解并定容至100mL，用760CRT雙光束紫外可見分光光度計(jì)在200～650nm范圍內(nèi)分別進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，得到色素的吸收光譜圖。

1.2.3 最佳樹脂類型的篩選

1.2.3.1 樹脂的預(yù)處理 5種大孔樹脂分別用無水乙醇浸泡24h，充分溶脹，用無水乙醇淋洗至洗出液加適量水(1∶5)無白色渾濁為宜，用去離子水洗至無醇，吸干樹脂中水分，然后用5%HCl浸泡3h，用去離子水洗至中性，再用2%NaOH浸泡3h，用去離子水洗至中性，吸干樹脂中水分備用［14－15］。

1.2.3.2 樹脂吸附率和解吸率的測(cè)定 分別準(zhǔn)確稱取5種預(yù)處理大孔樹脂3份，每份2.0g，置于100mL三角瓶中，用pH 3.0檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液稀釋“黑美人”土豆色素，在波長(zhǎng)521nm處測(cè)其吸光值A(chǔ)0。分別取其20mL加入到盛有2.0g樹脂的三角瓶中，用保鮮膜封口，在室溫避光條件下靜置24h，充分吸附后，過濾，測(cè)濾液吸光值A(chǔ)1;向?yàn)V出的樹脂中加入20mL pH 3.0的酸性乙醇溶液，用保鮮膜封口，室溫避光靜置24h，充分解吸后過濾，測(cè)濾液的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算吸附率α和解吸率β［16］。

1.2.4 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 “黑美人”土豆色素在AB－8樹脂上吸附平衡時(shí)間的測(cè)定 測(cè)定“黑美人”土豆色素稀釋液吸光值A(chǔ)0，取20mL置于100mL三角瓶中，加入預(yù)處理樹脂2.0g，用保鮮膜封口，在室溫避光條件下靜置，每隔1h測(cè)定溶液的吸光度并計(jì)算吸附率，然后以吸附率對(duì)時(shí)間作圖，繪制靜態(tài)吸附曲線。

1.2.4.2 pH對(duì)AB－8樹脂吸附的影響 分別配制pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的檸檬酸－檸檬酸鈉色素液。稱取處理好的AB－8樹脂7份，每份2.0g，分別置于三角瓶中，加入各pH色素溶液20mL，用保鮮膜封口，在室溫避光條件下靜置8h，過濾，在521nm處測(cè)濾液吸光值，繪制靜態(tài)吸附曲線。

1.2.4.3 溫度對(duì)AB－8樹脂吸附的影響 將配制好的pH 3.0的檸檬酸－檸檬酸鈉色素溶液，分別取20mL加入置有2.0g預(yù)處理樹脂的三角瓶中，用保鮮膜封口，分別在溫度20、30、40、50、60、70℃恒溫水浴鍋中保溫8h，立即冷卻后，在521nm處測(cè)定不同溫度下色素液的吸光值，繪制靜態(tài)吸附曲線。

1.2.5 靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 “黑美人”土豆色素在AB－8樹脂上解吸平衡時(shí)間的測(cè)定 稱取吸附色素飽和樹脂2.0g，加入pH 3.0的酸性乙醇溶液20mL，用保鮮膜封口，在室溫避光條件下靜置，每隔1h測(cè)定溶液的吸光度，并對(duì)時(shí)間作圖，繪制靜態(tài)解吸曲線。

1.2.5.2 不同乙醇濃度(pH 3.0)對(duì)AB－8樹脂解吸效果的影響 稱取2.0g吸附飽和的AB－8樹脂5份，置于三角瓶中，依次加入20mL濃度為50%、60%、70%、80%、90%的pH 3.0乙醇溶液，用保鮮膜封口，在室溫避光條件下靜置洗脫2h，在521nm處測(cè)其吸光值，繪制靜態(tài)解吸曲線。

1.2.6 “黑美人”土豆色素的AB－8樹脂柱層析 經(jīng)預(yù)處理的樹脂排水法裝柱，層析柱內(nèi)徑2.5cm，樹脂高10cm。根據(jù)靜態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)色素進(jìn)行上柱純化。粗色素濃度為1mg/mL，以90%酸性乙醇(pH 3.0)洗脫，1.0mL/min進(jìn)行收集，每管收集5mL，取一定量的收集液，用pH 3.0的檸檬酸緩沖液稀釋后，在521nm處測(cè)定色素液的吸光度，以收集管數(shù)為橫坐標(biāo)，色素的吸光度(乘以稀釋倍數(shù))為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線，合并洗脫液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮冷凍干燥后測(cè)定色價(jià)。

1.2.7 AB－8樹脂對(duì)“黑美人”土豆色素純化效果 精確稱取1.0g“黑美人”土豆色素粘稠液，用pH 3.0的酸性乙醇溶液稀釋至100mL，吸取1mL用酸性乙醇稀釋至10mL，在最大波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。準(zhǔn)確稱取1.2.6中純化的色素20mg用pH 3.0的酸性乙醇溶液稀釋至10mL，稀釋10倍后在最大波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)文獻(xiàn)［17］計(jì)算純品和粗品色價(jià)。

式中:A為吸光度，f為測(cè)定吸光度時(shí)所吸取樣品的稀釋倍數(shù)，m為樣品的質(zhì)量(g)。

以上各指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)3次，圖表中所有數(shù)據(jù)均為三次數(shù)據(jù)的平均值。使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，各樹脂間的顯著性差異采用Duncan新復(fù)極差法比較。

表1 五種大孔樹脂對(duì)于“黑美人”土豆色素吸附及解吸特征Table 1 Chemical and physical properties of resins and their absorption and desorption properties on pigment from“Black Beauty”potato

2 結(jié)果與分析

2.1 色素的吸收光譜

由圖1可知，“黑美人”土豆色素在pH 3.0的酸性乙醇溶液和pH 3.0的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液中，其最大吸收峰分別在536、521nm處，且在pH 3.0的酸性乙醇溶液中導(dǎo)致最大吸收波長(zhǎng)紅移，兩種溶劑的吸收峰都在465～560nm范圍內(nèi)，這表明“黑美人”土豆色素是花色苷類色素［13，18－20］。

圖1 “黑美人”土豆色素的紫外－可見光譜圖Fig.1 UV－visible spectra of pigment from“Black Beauty”potato

2.2 最佳樹脂類型的篩選

不同類型的樹脂對(duì)色素的吸附程度不同，影響大孔吸附樹脂的吸附性能的因素有很多，包括樹脂的結(jié)構(gòu)、極性、比表面積、粒徑、孔徑以及與被吸附分子的極性、分子大小。一般來說，樹脂的極性與被吸附分子的極性相同或相近時(shí)吸附效果更好;樹脂有較大的比表面積時(shí)吸附量更大;樹脂孔徑是被吸附分子大小的5～6倍時(shí)吸附性能最好，因此篩選樹脂時(shí)要綜合考慮樹脂的極性、比表面積和孔徑等因素［21］。從表1可以看出，NKA－Ⅱ是極性樹脂，比表面積最小，故NKA－Ⅱ樹脂的吸附效果最差;D4020、X－5都是非極性樹脂，但D4020樹脂比表面積大于X－5樹脂，因此D4020樹脂吸附效果較好;X－5樹脂比NKA－9樹脂比表面積大，但NKA－9樹脂極性比X－5樹脂強(qiáng)，因此吸附率稍大一些;AB－8樹脂比表面積小于X－5樹脂，但是AB－8樹脂極性比X－5樹脂強(qiáng)，因此吸附率高。如圖2所示，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行比較，從吸附率看，AB－8、NKA－9、X－ 5、NKA－Ⅱ、D4020大孔樹脂之間差異不顯著(p＜0.01);從解吸率看，NKA－Ⅱ、X－5、D4020大孔樹脂之間差異不顯著，AB－8、NKA－9和其它大孔樹脂相比較差異極顯著。綜合吸附率和解吸率兩個(gè)參數(shù)，認(rèn)為AB－8類型樹脂是比較好的吸附樹脂，故以下實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考查AB－8大孔樹脂對(duì)“黑美人”土豆色素的純化效果。

圖2 5種大孔樹脂對(duì)黑美人色素吸附率和解吸率的影響Fig.2 Effects of absorption and desorption of five types of macroporous resins on pigment from“Black Beauty”potato

2.3 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

2.3.1 “黑美人”土豆色素在AB－8樹脂上的吸附曲線 從圖3可以看出，在1h時(shí)“黑美人”土豆色素的吸附率已經(jīng)達(dá)到了70%，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附逐漸達(dá)到飽和，當(dāng)吸附8h時(shí)，AB－8樹脂對(duì)“黑美人”土豆色素的吸附達(dá)到平衡，當(dāng)吸附時(shí)間超過8h，吸附率緩慢增加，因此，后續(xù)吸附實(shí)驗(yàn)采用8h作為吸附時(shí)間。

圖3 AB－8大孔樹脂對(duì)黑美人土豆色素的吸附曲線Fig.3 Absorption curve of pigment from“Black Beauty”potato by AB－8 resin

2.3.2 pH對(duì)AB－8樹脂吸附的影響 溶液的pH會(huì)改變色素的存在形式和溶解度，從而會(huì)影響樹脂的吸附和解吸附。從圖4可以看出，當(dāng)pH為3時(shí)，吸附率較大，吸附效果較好，當(dāng)pH繼續(xù)上升時(shí)吸附率明顯降低，這可能是由于花色苷的性質(zhì)受溶液pH的影響所致，從而影響吸附效果。所以在用AB－8樹脂純化“黑美人”土豆色素時(shí)，上樣液的pH應(yīng)控制在3.0左右。

圖4 pH對(duì)黑美人土豆色素吸附率的影響Fig.4 Effects of pH value on absorption rate of pigment from“Black Beauty”potato

2.3.3 溫度對(duì)AB－8樹脂吸附的影響 從圖5可以看出，“黑美人”土豆色素吸附率隨溫度的升高呈先上升然后下降的趨勢(shì)，在70℃時(shí)驟然升高，這是因?yàn)樯卦跍囟容^低時(shí)相對(duì)比較穩(wěn)定，溫度升高使樹脂對(duì)色素的吸附率降低，當(dāng)溫度達(dá)到70℃色素不穩(wěn)定，有部分色素性質(zhì)發(fā)生變化，使吸光值偏低，導(dǎo)致計(jì)算的吸附率偏高。因此，吸附時(shí)在40℃條件下效果最佳。

圖5 溫度對(duì)黑美人土豆色素吸附率的影響Fig.5 Effect of temperature on absorption rate of pigment from“Black Beauty”potato

2.4 靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

2.4.1 “黑美人”土豆色素在AB－8樹脂上的解吸曲線 從圖6可以看出，在起初的一段時(shí)間內(nèi)，“黑美人”土豆色素的吸光值在逐漸增加，當(dāng)解吸時(shí)間2h時(shí)，解吸基本達(dá)到平衡，延長(zhǎng)至5h色素吸光值不再增加。

2.4.2 不同濃度乙醇(pH 3.0)溶液對(duì)AB－8樹脂解吸效果的影響 從圖7可以看出，乙醇濃度越高，色素的解吸率越高，這是由于乙醇是一種極性溶劑，它的加入可以使大孔樹脂溶脹，減弱被吸附物質(zhì)與樹脂之間的吸附力，增加色素的溶解度，從而增大樹脂的解吸率。因此，宜選用高濃度的乙醇作為洗脫劑。

2.5 “黑美人”土豆色素動(dòng)態(tài)洗脫曲線

洗脫曲線如圖8所示，以吸光度作為溶液色素含量的表征，則洗脫高峰約為40mL洗脫液洗脫了占總洗脫量90.13%的色素，當(dāng)洗脫液用去2.2倍柱床體積即110mL時(shí)，洗脫液幾乎呈無色，說明色素已基本解吸完全。因此，用90%的pH 3.0乙醇溶液可以較好解析AB－8樹脂吸附的“黑美人”土豆色素，也證明AB－8樹脂對(duì)“黑美人”土豆色素的靜態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可行的。

圖6 AB－8大孔樹脂對(duì)黑美人土豆色素的解吸曲線Fig.6 Desorption curve of pigment from“Black Beauty”potato by AB－8 resin

圖7 pH 3.0乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑美人土豆色素解吸的影響Fig.7 Effect of ethanol concentrations at pH 3.0 on desorption of pigment from“Black Beauty”potato

圖8 “黑美人”土豆色素的動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.8 Dynamic elution curve of pigment from“Black Beauty”potato

2.6 純化前后“黑美人”土豆色素色價(jià)的比較

純化后的“黑美人”土豆色素經(jīng)濃縮干燥后為黑紫色粉末，測(cè)定其色價(jià)為43.15，而粗品的為4.59，純化后色素的色價(jià)明顯提高，是粗提物的9.4倍，且比粗品的提高了8.4倍。

3 結(jié)論與討論

3.1 5種大孔吸附樹脂對(duì)“黑美人”土豆色素的吸附和解吸效果比較表明，AB－8大孔樹脂對(duì)“黑美人”土豆色素的吸附和解吸效果較好，適合于該色素的純化?！昂诿廊恕蓖炼股卦贏B－8樹脂上吸附平衡時(shí)間為8h，解吸平衡時(shí)間為2h，在吸附液pH 3.0、溫度為40℃時(shí)吸附能力最強(qiáng);以pH 3.0的90%的乙醇為洗脫液的洗脫效果較好。

3.2 經(jīng)AB－8大孔吸附樹脂純化后的色素色價(jià)比粗品提高了8.4倍。該方法具有效率高、成本低、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，易于實(shí)現(xiàn)“黑美人”土豆色素工業(yè)化生產(chǎn)。

3.3 本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)AB－8大孔吸附樹脂對(duì)“黑美人”土豆色素的靜態(tài)吸附和解吸效果進(jìn)行了研究，后續(xù)將對(duì)色素動(dòng)態(tài)的吸附和解吸效果、樹脂的重復(fù)使用及色素各組分的分離和活性進(jìn)行研究。

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Study on the preliminary purification of pigment from“Black Beauty”potato by macroporous resin

ZHANG Yong1，LI Cai－xia1，*，MA Bei－bei1，WANG Xing－de2，WANG Xiu－mei1
(1.College of Agriculture and Biotechnology，Hexi University，Zhangye 734000，China; 2.Agriculture Comprehensive Development Office of Minle County，Minle 734503，China)

The absorption and desorption effects of 5 kinds of macroporous absorption resins on pigment from“Black Beauty”potato were compared，and the properties of static adsorption and desorption for AB－8 on“Black Beauty”potato pigment were further investigated.The results showed that the time of absorption and desorption equilibrium were 8h and 2h.Under the conditions of pH 3.0 and 40℃，the highest adsorpion ability for“Black Beauty”potato pigment was achieved，and elution the effect was better by using 90%ethanol solution at pH 3.0，which resulted in a 8.4－fold increase of color value.The results indicated that AB－8 resin could be used for separating and purifying for pigment from“Black Beauty”potato.

“Black Beauty”potato pigment;macroporous absorption resin;purification

TS255.1

B

1002－0306(2012)02－0345－05

2011－01－24 *通訊聯(lián)系人

張勇(1963－)，男，教授，博士，研究方向:植物學(xué)、植物分子生物學(xué)。

民樂縣科技局與河西學(xué)院合作項(xiàng)目。