一株嗜鹽古菌DSFD111的分類學鑒定

程露露，傅金辰，楊丹丹，張含薇，俞姍杉，陳 敏

(杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 310036)

一株嗜鹽古菌DSFD111的分類學鑒定

程露露，傅金辰，楊丹丹，張含薇，俞姍杉，陳 敏

(杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 310036)

采用形態(tài)學和系統(tǒng)發(fā)育分析對一株嗜鹽古菌DSFD111進行了分類學鑒定.分離到的DSFD111菌株為革蘭氏陰性球菌，不產(chǎn)芽胞，細胞內(nèi)含類脂粒.最適生長溫度為37 ℃， 最適pH為7， 最適生長NaCl濃度為4.3 mol/L，表明該菌株屬于極端嗜鹽菌.根據(jù)16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，DSFD111菌株歸于鹽盒菌屬(Haloarcula)，與最近緣的Haloarculaargentinensis的相似度為99%.

嗜鹽古菌；菌種鑒定；16S rRNA

嗜鹽菌(Halophiles)是指生長需要鹽且在一定鹽濃度的環(huán)境中生長最佳的微生物[1].長期的選擇壓力使嗜鹽菌形成了對環(huán)境脅迫的適應機制，能夠產(chǎn)生多種嗜(耐)鹽功能酶及其他特殊性質(zhì)的活性物質(zhì)[2]，成為一類新型的、極具應用前景和開發(fā)潛力的極端微生物資源.

我國的云南、新疆和內(nèi)蒙古等地區(qū)存在著數(shù)量眾多的鹽湖或鹽堿湖，對這類自然高鹽環(huán)境中的嗜鹽微生物已有較多的研究[3-6].而我國東部沿海地區(qū)擁有眾多的鹽田、鹽場，是典型的人工高鹽環(huán)境，對此類環(huán)境中的包括中度嗜鹽菌在內(nèi)的微生物的研究相對還較少[7-9].岱山是浙江省最大的產(chǎn)鹽縣，島上有數(shù)萬畝鹽田，為研究鹽田環(huán)境嗜鹽菌資源提供了極好的條件.2010年，本實驗室從岱山鹽場采集土壤及鹵水樣品，利用選擇性培養(yǎng)基共分離得到181株嗜鹽菌菌株，其中DSFD111菌株經(jīng)檢測具有較高的淀粉酶和脂肪酶活性(結(jié)果已另文報道)，本研究主要對DSFD111菌株進行分類學鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，為進一步的開發(fā)應用提供理論基礎.

1 材料和方法

1.1 菌株

DSFD111菌株：分離自岱山鹽場鹵水樣品，本實驗室保存.

1.2 培養(yǎng)基

嗜鹽菌RM培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O,20.0 g·L-1;檸檬酸鈉,3.0 g·L-1;KCl,2.0 g·L-1;無水CaCl2,0.2 g·L-1;細菌蛋白胨(L 37),10.0 g·L-1;NaCl,250 g·L-1;瓊脂,15.0 g·L-1;pH 7.0.

1.3 形態(tài)學鑒定

1.3.1 菌落形態(tài)：取試管斜面保藏的菌種在25% NaCl的RM固體平板培養(yǎng)基上劃線，保鮮膜包覆，倒置在37 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，觀察平板上單菌落的顏色、大小、形狀、邊緣、表面突起及透明程度等.

1.3.2 菌體形態(tài)[10]：載玻片上滴1滴已滅菌的25% NaCl溶液，從平板上挑取新鮮培養(yǎng)的菌種，涂片風干后，以2% 的冰乙酸覆蓋5 min固定脫鹽，洗去多余的乙酸并晾干；用結(jié)晶紫覆蓋1～2 min進行簡單染色，蒸餾水洗去染液，晾干，普通光學顯微鏡觀察細胞的形狀，并測定其大小.

1.3.3 革蘭氏染色：涂片方法同上.革蘭氏染色用結(jié)晶紫初染90 s，水洗，滴加盧戈氏(Lugol’s)碘液沖去殘水，覆蓋1 min，水洗，95%的乙醇滴洗，直至流出的液體不呈紫色，約20～30 s，立即水洗，0.5%番紅水溶液復染1～2 min，水洗，晾干后鏡檢.

1.3.4 芽孢染色：采用改良Schaeffer-Fulton染色法，取1～2滴無菌鹽水于小試管中，用接種環(huán)挑取培養(yǎng)2周的菌體于該試管中，充分打散混勻，制成濃稠的菌懸液.加2～3滴5% 的孔雀綠染液于小試管中，輕輕搖晃，使染液與菌液充分混合.將小試管用沸水浴加熱15～20 min.用接種環(huán)從試管底部挑取幾環(huán)菌液于潔凈的載玻片上，制成涂片，通過酒精燈火焰2～3次固定，晾干.水洗至流出的水無綠色止.加0.5% 番紅水溶液復染 5 min，傾去染液，用吸水紙吸干.油鏡下觀察.

1.3.5 類脂粒(PHB)顆粒檢測[11]：按1.3.2的方法制備涂片.蘇丹黑染液染10 min，用水沖去染劑，再用二甲苯?jīng)_洗涂片至無色素洗脫.用0.5%番紅復染1～2 min，水洗，干燥，鏡檢.類脂粒染成藍黑色，菌體其他部分呈紅色.

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

1.4.1 菌體DNA的提取[12]：純化后的單菌落接種至相應NaCl濃度的液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min恒溫光照搖床培養(yǎng)過夜.取1 mL培養(yǎng)好的菌懸液至1.5 mL離心管中，10 000 r/min高速離心5 min，棄去上清液，加無菌水1 mL沖洗，充分旋渦后離心去上清液，重復2次.加雙蒸水100 μL，旋渦震蕩器充分震蕩懸浮，加保鮮膜封口，于沸水浴中煮沸10 min，取出后立即置于冰中.瞬時高速離心，直接取2 μL上清液作為PCR反應模板.

1.4.2 16S rRNA 擴增：采用古菌通用引物[13]22：5′-ATTCCGGTTGATCCTGC-3′和1540R：5 ′-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3′， PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min.1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，穩(wěn)定電壓90 V，電泳25 min.

圖1 菌株DSFD111菌落形態(tài)Fig. 1 The colony morphology of strain DSFD111

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及分析：PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物公司進行序列測定.測序結(jié)果提交到GenBank得到基因序列登錄號，并通過EzTaxon server 2.1尋找相似性較接近的幾個模式菌株的16S rRNA序列，利用MEGA5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹.

1.5 生理生化鑒定

依據(jù)文獻[11,14]中相關內(nèi)容進行.

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學鑒定

將菌株DSFD111于RM平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)1周后觀察，菌落呈紅色、圓形、直徑約3 mm、表面光滑、邊緣整齊、中間有突起(如圖1).在光學顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，呈球狀，直徑約1.5 μm.革蘭氏染色陰性，不產(chǎn)芽胞，細胞內(nèi)含類脂粒.

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

擴增菌株DSFD111的16S rRNA基因序列，將PCR產(chǎn)物進行序列測定，測序結(jié)果提交至 GenBank得到基因序列登錄號為JQ068948.查找與該菌株親緣關系較近的已發(fā)表的10個模式菌株的16S rRNA序列，采用MEGA 5.0軟件包中的Kimura 2-Parameter model及Neighbor-Joining法進行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果如圖2所示.

圖2 菌株DSFD111 及其近緣種構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree showing the relationship between DSFD111 and the type species in Haloarcula

結(jié)果表明，菌株DSFD111與Haloarcula屬中的Haloarculaquadrata801030/1T，HaloarculavallismortisCGMCC1.2048T，HaloarculaargentinensisJCM9737T，HaloarculaamylolyticaBD-3T以及HaloarculajaponicaJCM7785T聚為一支，說明與它們都有較近的親緣關系，其中與最近緣的HaloarculaargentinensisJCM9737T的相似度為99%.因此，分子鑒定結(jié)果DSFD111歸于Haloarcula屬.

2.3 生理生化特征

根據(jù)分子鑒定結(jié)果，選擇模式菌株HaloarculaargentinensisJCM9737[15]為參照菌株，進行了部分的生理生化試驗，結(jié)果見表1.

表1菌株DSFD111的生理生化特性
Tab.1PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofstrainDSFD111

特性HaloarculaargentinensisJCM9737TDSFD111最適生長NaCl濃度/(mol/L)2.5～3.04.3最適生長溫度/℃4037最適生長pHNR7.0革蘭氏染色--運動性++過氧化氫酶++H2S形成NR-硝酸鹽還原NR+甲基紅試驗NR+伏-普試驗NR+明膠水解++淀粉水解++酪素水解NR-吐溫80++糖發(fā)酵 葡萄糖++ 果 糖NR+ 麥芽糖++ 蔗 糖++ 木 糖NR- 甘露醇-- 甘露糖++ 半乳糖++ 山梨醇-- 核 糖++ α-乳糖--

+：陽性；-：陰性； NR：未見報道.

以上結(jié)果表明，DSFD111菌株的主要生理生化特征與Haloarculaargentinensis標準菌株基本吻合.綜合上述形態(tài)、生理生化特性以及16S rRNA基因測序結(jié)果，初步鑒定DSFD111菌株為Haloarculaargentinensis.

3 討 論

嗜鹽古菌一般棲居在海水、日光曬鹽池、天然鹽湖或人工腌制食品的表面，在接近飽和的高鹽環(huán)境中，屬優(yōu)勢種群.由于早期的分類鑒定多側(cè)重于形態(tài)和生理生化特性，嗜鹽古生菌的分類地位一直倍受爭議.直到20世紀70年代末三域?qū)W說(Three domains)[16]的提出，把微生物劃分為細菌域(Bacteria)、古菌域(Archaea)、真核生物域(Eukarya)3個分類單元，并從細胞結(jié)構(gòu)、遺傳機制等方面與細菌域和真核生物域相比較，發(fā)現(xiàn)古生菌確實與真細菌和真核生物存在很大不同[17]，同時在方法上建立了以16S rRNA基因為指征的序列分析技術(shù)，大大推進了古生菌菌種鑒定的相關研究.

嗜鹽古菌的分類地位歸屬于古菌域(Archaea)、廣古菌門(Euryarchaeota)、鹽桿菌綱(Halobacteria)、鹽桿菌目(Halobacteriales)、鹽桿菌科(Halobacteriaceae)，目前僅此一科.1957年，Elazari-Volcani提出了鹽桿菌科的第一個屬，即鹽桿菌屬(Halobacterium)[18].隨后，Gibbons于1974年確立了鹽球菌屬(Halococcus)，是鹽桿菌科的第二個屬[19].2001年，伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊依據(jù)16S rRNA基因序列分析結(jié)果、極性脂的組分、細胞形態(tài)及一些其它的表型特征，將鹽桿菌科劃分為15個屬[20].到2009年，該科已包含27個屬，96個正式發(fā)表的種[21].

本研究對嗜鹽古生菌DSFD111進行了16S rRNA序列同源性分析.擴增結(jié)果與GeneBank上的標準序列進行比對，結(jié)果顯示，DSFD111菌株與Haloarculaargentinensis標準序列比較同源性在99%以上.進一步的生理生化鑒定結(jié)果表明，其主要特征與Haloarculaargentinensis標準菌株基本吻合.因此，初步鑒定DSFD111菌株為Haloarculaargentinensis，是一株極端嗜鹽古生菌.

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IdentificationofaHalophilicArchaeaDSFD111

CHENG Lu-lu, FU Jin-chen, YANG Dan-dan, ZHANG Han-wei, YU Shan-shan, CHEN Min

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

A halophilic archaea DSFD111 was identified based on morphology and phylogenetic analysis. The strain is Gram-negative bacteria, no spores and contains lipid particles. The best growth environment of the strain is 37 ℃, pH 7 and 4.3 mol/L NaCl, which indicates that the strain is extreme halophiles. The phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene homology shows that the strain belongs toHaloarcula, and shares 99% similarity withHaloarculaargentinensis.

halophilic archaea; strain identification; 16S rRNA

2012-07-03

杭州市科技發(fā)展計劃項目(20101032B26).

陳 敏(1963—)，女，教授，主要從事微生物研究.E-mail:mchen63@163.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2012.06.004

Q93

A

1674-232X(2012)06-0495-05