瓊脂糖電泳中核酸染料Goldview最佳使用方案的建立

王 燕，彭莉萍，羅鎮(zhèn)明

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 生物化學與細胞分子生物學教研室，廣東 珠海 519041)

瓊脂糖電泳中核酸染料Goldview最佳使用方案的建立

王 燕，彭莉萍，羅鎮(zhèn)明

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 生物化學與細胞分子生物學教研室，廣東 珠海 519041)

目的確定瓊脂糖凝膠電泳中使用核酸染料Goldview的最佳濃度和方法，盡可能減少實驗中Goldview用量，控制其對實驗室環(huán)境的污染。方法配置含不同濃度Goldview的上樣緩沖液，混合不同濃度 DNA溶液的瓊脂糖凝膠電泳，然后對比預染樣品法、前染法及后染法的染色效果。結果實驗結果顯示上樣緩沖液中含0.4% Goldview的預染樣品法電泳檢測核酸的效果最佳且能檢測的核酸樣品濃度在16.5ng或以上為最佳。結論核酸染料Goldview在核酸的瓊脂糖凝膠電泳中使用的最佳方案為預染樣品法，實驗中推薦濃度達到普通實驗要求，并且最易控制對周圍環(huán)境的污染。

瓊脂糖凝膠電泳；核酸染料；Goldview

目前實驗室中所用的核酸染料主要有EB(溴化乙啶)、SYBR Green I和Goldview等。作為核酸染料它們對人體都存在一定程度的危害。EB作為一種常規(guī)的核酸染料曾廣泛的被應用于瓊脂糖凝膠[1]和聚丙烯酰胺凝膠[2]中DNA與RNA的觀察和檢測，但EB是一種誘變劑，可插入核酸相鄰堿基平面之間，引起基因突變，具有中等毒性，對人體有潛在的危害性[3]。SYBR Green I是近些年新推出的一種熒光核酸染料，因其危害性較低而逐漸成為EB的替代品之一[4]，但ssDNA的檢測靈敏度不高，效果不好，應用于DNA凝膠電泳中穩(wěn)定性不高。目前瓊脂糖凝膠電泳中Goldview已被廣泛使用，其染色效果和靈敏度與EB相近，且未證實有致癌性[5]，是EB較理想的替代品。但它穿透能力強，對眼睛和皮膚有明顯的刺激性。實驗中由于Goldview的用量過大或實驗員的不慎，導致桌面、扶手、門鎖等多處被污染。實驗室中使用Goldview進行染色的方法主要有前染法和后染法[6]，但在以往的實驗中曾發(fā)現(xiàn)預染樣品法信噪比高，條帶邊緣銳利。因此，本實驗旨在探索上樣緩沖液中Goldview的最佳濃度值，使其染色效果與前染法和后染法相近，同時又可節(jié)省Goldview的用量，降低成本，也可減少Goldview對實驗室的污染及對人體的危害，以便在實驗室中推廣應用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 DYY-2C型電泳儀(北京六一儀器廠)、ZF1-Ⅱ紫外線凝膠成像系統(tǒng)(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2 主要試劑 GoldviewTM核酸染料I(北京莊萌國際生物基因科技有限司)、6×Loading buffer(上海捷瑞生物工程有限公司)、DNA Marker(含6種不同大小的DNA 片段,其大小分別為2 000、1 000、750、500、250和100 bp,加亮帶750 bp的DNA 片段濃度是30 ng/μl，其余都是10 ng/μl)(寶生物工程(大連)有限公司)、西班牙瓊脂糖(上海生物工程有限公司)、5xTBE電泳緩沖液、質粒pEGFP-C1(上海生工生物工程公司)和RNA(生化教研室保存)。

1.3 方法 實驗中用Goldview對核酸染色主要通過3種方法：①前染法，即在配置瓊脂糖凝膠中加入Goldview，用量一般為1%的20 mL膠溶液加入15 μl；②后染法，即在水中加人Goldview，一般100 mL加5 μl，再將電泳后的膠塊浸泡染色；③預染樣品法，將含一定濃度Goldview的上樣緩沖液與樣品一起混合進行上樣，電泳。

1.3.1 前染法對DNA marker的染色 在20 mL 1%的瓊脂糖凝膠中加入1 μl Goldview，混勻后倒板；將5.0 μl不同濃度的 DNA Marker分別與5.0 μl上樣緩沖液充分混勻(見表1)，上樣，在101 V電壓下進行電泳20 min，于紫外線凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察。

1.3.2 后染法對DNA marker的染色 配置20 mL 1%的瓊脂糖凝膠,倒板；將5.0 μl不同濃度的 DNA Marker分別與5.0 μl上樣緩沖液充分混勻(見表1)，上樣，于101V電壓下電泳20 min后，將膠塊放于20 mL加了1 μl Goldview的水中染色5 min，于紫外線凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察。

1.3.3 預染樣品法中Goldview最佳染色濃度的確定 將5.0 μl DNA Marker分別與5.0 μl 不同濃度(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%)的含Goldview 上樣緩沖液充分混勻后,進行1 %瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)凝膠成像結果,確定Goldview的最佳染色濃度為0.4%。

1.3.4 預染樣品法對DNA marker的染色 將5.0 μl含0.4%Goldview的上樣緩沖液與5.0 μl 不同濃度的DNA Marker一起混合上樣(見表1)，在101V電壓下電泳20 min后于紫外線凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察。

表1 3種方法的上樣量

2 結果

2.1 3種染色方法 DNA的檢測結果較前染法靈敏度高，但是背景高，信噪比較小(見圖1)；使用后染法染色，條帶出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象，某些條帶邊緣比較銳利、清晰(見圖2)；使用預染樣品法染色，背景低，信噪比相對高，條帶邊緣銳利，便于顯示實驗結果(見圖3)。將3圖進行比較分析。

2.2 RNA和質粒在最佳染色濃度下的檢測結果瓊脂糖凝膠電泳經常用于核酸的檢測，RNA電泳的電泳結果清晰可見28s和18s的rRNA條帶及mRNA彗星尾圖形(見圖4)，染料在對RNA染色中均能夠起到區(qū)分條帶、顯示濃度差異和有無降解的鑒定作用。實驗中DNA電泳出現(xiàn)了明顯的三條帶，泳動速率最快的是雙鏈環(huán)狀DNA、其次是線性的DNA，最慢的是單鏈開環(huán)DNA(見圖5)。

注：1，2，3 稀釋一倍的DNA；4,5,6稀釋兩倍的DNA；7，8，9未經稀釋的DNA;除了750bp處條帶濃度從左往右分別是50ng/條帶，75 ng/條帶,150 ng/條帶,其余條帶濃度均為16.5ng/條帶，25 ng/條帶,50 ng/條帶。

3 討論

Goldview作為一種新型的核酸染料，不僅能染DNA，也可用于染RNA，可以檢測10ng以上的核酸[7]，以其毒性較低，靈敏度高，該染料穩(wěn)定性也比較好，4℃避光保存即可，價格是這3種染料中最便宜的[8]，在瓊脂糖凝膠電泳中逐步得到了廣泛應用。

DNA條帶的Goldview染色強度隨著DNA濃度的增大而增強，但是小片段的DNA出現(xiàn)了明顯的拖尾現(xiàn)象，并且是濃度越大現(xiàn)象越明顯[9]。結果表明，對于100bp的條帶而言，預染樣品法拖尾程度明顯降低，并且隨著濃度降低，條帶邊緣銳利，而前染法和后染法邊緣依然模糊，出現(xiàn)扭曲[10]，無規(guī)則；對于小于750 bp條帶而言，后染法的拖尾現(xiàn)象非常明顯，并且濃度越高拖尾現(xiàn)象越明顯，而前染法的條帶邊緣不規(guī)則。

在樣品濃度為16.5 ng/條帶時，3種方法的電泳條帶均可見，電泳靈敏度達到了普通實驗室的要求。但是相對于前染法和后染法中Goldview 1μl的用量而言，預染樣品法在10 μl上樣量的凝膠里，Goldview在上樣緩沖液中濃度為0.4%的條件下的總用量最多為0.18 μl(在十一個孔的凝膠里)，就可以節(jié)約0.82 μl Goldview，并且預染樣品法條帶的亮度均達到一定的效果，通過實驗可以發(fā)現(xiàn)在樣品中加入Goldview可以明顯的減少其用量，降低污染。

本研究結果對于實驗室常規(guī)應用的Goldview核酸染料的使用方案提供了科學的理論，盡管前染法對于DNA 條帶的靈敏度略高于預染樣品法，但是預染樣品法已適合于常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳中核酸分子的檢測，是較好的選擇。

[1] 黃永蓮.瓊脂糖凝膠電泳實驗技術研究[J].湛江師范學院學報,2009,30(6):83-85.

[2]王霞,王燁,李琳琳,等.瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測腸道菌群基因擴增產物的方法學比較研究[J].新疆醫(yī)學,2008,38(5):136-138.

[3]蔣玲艷,王林果.核酸染料的應用研究進展[J].玉林師范學院學報,2006,27(3):131-133.

[4]SingerVL-LawlorTE ,Yue S.Comparison of SYBR GreenI nucleic acid gel stain mutsgenieity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsong reverse mutation assay(Amesteat )[J].Mutant Res,1999,439(37):37-47.

[5]蔣玲艷,王林果.兩種核酸染料染色效果的比較研究[J].生物技術通報,2006,11(17)：924-926.

[6]曹秀華,王亞婷,李麗,等.瓊脂糖凝膠電泳的條件優(yōu)化——質粒DNA重組片段的限制性內切酶譜鑒定[J].齊齊哈爾醫(yī)學院學報,2011,32(1):9-11.

[7]張全渡，冉黎，陸長膏,等.四種核酸熒光染料在瓊脂糖凝膠中染色特性的比較分析[J].四川解剖學雜志,2007,15(3):29-31.

[8]劉陽,楊淑霞,李敏惠,等.三種染色方式下四種核酸染料的靈敏度比較[J].成都醫(yī)學院學報,2008,3(1)：20-23.

[9]黃慶,府偉靈,趙渝徽,等.核酸熒光染料在瓊脂糖凝膠電泳中的染色特性[J].Chin J Nosoeomiol,2006,ll(16):1316-1318．

[10]劉陽，楊淑霞，賴翼,等.影響瓊脂糖凝膠電泳條帶扭曲程度的因素[J].生物學雜志，2009，26(2)：70-72.

EstablishmentoftheoptimalschemeofthenucleicaciddyesGoldviewintheagarosegelelectrophoresis

Wangyan,Pengliping,Luozhenming

(Department of Biochemistry and Molecular Biology,the Zhuhai Campus of Zunyi Medical College,Guangdong Zhuhai 519041,China)

ObjectiveTo confirm the optimal concentration and methods of nucleic acid dyes Goldview used in the agarose gel electrophoresis to reduce the amount of Goldview and further control its pollution to the laboratory environment.MethodsDifferent concentrations of Goldview in the loading buffer were prepared and mixed with different concentrations of DNA solution in the agarose gel electrophoresis.The pre-staining,routine nucleic acid staining and staining after electrophoresis were compared.ResultsThe loading buffer containing 0.4% Goldview in the pre-staining method was best,in which the optimal concentration in the nucleic acid samples was 16.5 ng or above.ConclusionThe optimal scheme of the nucleic acid dyes Goldview in agarose gel electrophoresis is the pre-staining method with the recommended concentrations to meet the common experiment requirement and the easiest way to control the pollution to the surrounding environment.

Agarose gel electrophoresis; nucleic acid dye; Goldview

貴州省科技計劃項目(NO：黔科合OZ字[2009]02);貴州省科學技術基礎項目(NO：黔科合J字[2008]2318)。

Q33

A

1000-2715(2012)04-0276-03

[收稿2012-06-08；修回2012-07-06]

(編輯：譚秀榮)