研磨法和組織分離器制備乳腺癌腋窩淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液的比較

陳相彪，楊偉明，陸 婧,王春林,唐 聃,賀新媛,駱禮波,石 磊

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 甲狀腺乳腺外科，貴州 遵義 563099)

·技術(shù)與方法·

研磨法和組織分離器制備乳腺癌腋窩淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液的比較

陳相彪，楊偉明，陸 婧,王春林,唐 聃,賀新媛,駱禮波,石 磊

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 甲狀腺乳腺外科，貴州 遵義 563099)

目的比較研磨法和Gentle MACS組織分離器制備乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液在活細(xì)胞率、絲狀物及細(xì)胞團(tuán)塊方面的優(yōu)缺點(diǎn)，為淋巴組織細(xì)胞培養(yǎng)和流式分析找到一種更為可靠的方法。方法分別用研磨法和Gentle MACS組織分離器制備單細(xì)胞懸液，臺盼蘭染色后計數(shù)活細(xì)胞、死細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)塊和絲狀物，并比較兩種方法的優(yōu)缺。結(jié)果兩種方法制備的腋窩淋巴組織單細(xì)胞懸液在細(xì)胞存活率方面有顯著性差異(P<0.05)。在絲狀物和細(xì)胞團(tuán)塊方面，組織分離器法絲狀物和細(xì)胞團(tuán)塊數(shù)量更少(P<0.05)。結(jié)論制備淋巴組織單細(xì)胞懸液，組織分離器法較研磨法更為優(yōu)異。

乳腺癌；淋巴組織 ；單細(xì)胞懸液

乳腺疾病是婦女的常見病和多發(fā)病，研究表明：乳腺疾病的患病率高達(dá)38.94%【1】。乳腺癌是婦女常見惡性腫瘤。我國乳腺癌發(fā)病率一直高居不下。乳腺癌研究一直是醫(yī)學(xué)界研究熱點(diǎn)。乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移一直是乳腺癌轉(zhuǎn)移途徑重要組成部分。研究乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移常需要制備乳腺癌淋巴組織單細(xì)胞懸液。近年來，F(xiàn)CM越來越多應(yīng)用于臨床檢測和科研實(shí)驗(yàn)【2】。乳腺癌腋窩淋巴組織單細(xì)胞懸液制備是研究乳腺癌先決條件。有關(guān)乳腺癌腋窩淋巴組織流式細(xì)胞術(shù)單細(xì)胞懸液的制備的研究顯得尤為重要。

流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)本制備是FCM檢測能否成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。單細(xì)胞懸液制備有機(jī)械法、機(jī)械-化學(xué)法、機(jī)械-酶消化法、單細(xì)胞懸液制備儀【2】。機(jī)械法主要是利用研磨法、網(wǎng)搓法和剪碎法。由于乳腺癌腋窩淋巴組織自身的特點(diǎn)以及各種制備方法自身優(yōu)缺點(diǎn)，研磨法對于較脆的組織(如脾臟)和淋巴結(jié)常會獲得較滿意的效果。近年來，組織分離器越來越多的應(yīng)用于各種組織單細(xì)胞懸液的制備。本文就這一問題展開討論，將研磨法和組織分離器制備單細(xì)胞懸液的方法做一比較，客觀的研究兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，探尋一種較為可靠的淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液的制備方法。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 離心機(jī)、 OLMPUS顯微、鏡細(xì)胞濾網(wǎng)(70um篩孔) 、移液器(10μl)、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、離心管、載玻片、研磨器、Gentle MACS組織分離器及C管電子天平。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、臺盼蘭染液、雙蒸水、PBS。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制備臺盼蘭染液 4%臺盼藍(lán)母液的配制：取4g臺盼藍(lán)，加少量蒸餾水進(jìn)行研磨，加雙蒸水至100 mL，用濾紙過濾，4℃保存，使用時用PBS稀釋至0.4% 。

1.3.2 每份標(biāo)本分為相同重量兩份，隨機(jī)分配到A組和B組。

1.3.3 A組，標(biāo)本剪碎至2～4mm大小碎片，置入gentle MACS C管中，按比例加RPMI1640培養(yǎng)基。Gentle MACS組織分離器上按操作說明制備單細(xì)胞懸液。B組，眼科剪將組織剪成碎片，放入研磨器內(nèi)，加入適量的PBS，緩慢轉(zhuǎn)動研磨棒，研磨至勻漿，PBS沖洗研磨器，收集所得懸液。

1.3.4 濾網(wǎng)過濾，離心(1000rpm)10 min，棄上清，吹打混勻并配成10 mL液體。再次吹打混勻。

1.3.5 移液器取同量細(xì)胞放在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上臺盼蘭染色3～5 min。

1.3.6 OLMPUS顯微鏡觀察細(xì)胞并拍照。鏡下觀察，死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染呈無色透明狀。

1.3.7 計數(shù)細(xì)胞并統(tǒng)計細(xì)胞活力、細(xì)胞團(tuán)塊、絲狀物數(shù)：活細(xì)胞率(%)= 活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.3.8 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)處理均采用(表1、表2、表3)SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行。半定量資料兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 1例乳腺癌腋窩淋巴節(jié)單細(xì)胞懸液計數(shù)結(jié)果(見圖1，2)

①Gentle MACS組織分離器法制備結(jié)果：

注：活細(xì)胞數(shù)：60個，死細(xì)胞數(shù)：52個，絲狀物：1個，細(xì)胞團(tuán)塊：0個，活細(xì)胞率：0.536(Trypan Blue ×200)。圖1 Gentle MAcs組織分離法制備單細(xì)胞懸液鏡下觀察結(jié)果

② 研磨法制備結(jié)果：

注：活細(xì)胞數(shù)：31個，死細(xì)胞數(shù)：123個，絲狀物：3個，細(xì)胞團(tuán)塊：2個，活細(xì)胞率：0.201(Trypan Blue ×200)。圖2 研磨法制備單細(xì)胞懸液鏡下觀察結(jié)果

2.2 兩種方法制備單細(xì)胞懸液活細(xì)胞率、絲狀物、細(xì)胞團(tuán)塊結(jié)果(見表1，2，3)

注：與研磨組相比P<0.05。

表2 兩種方法制備單細(xì)胞懸液絲狀物情況

注：與研磨組相比P<0.05。

表3 兩種方法制備單細(xì)胞懸液細(xì)胞團(tuán)塊情況

注：與研磨組相比P<0.05。

3 討論

單細(xì)胞懸液在許多方面具有廣泛用途：如腫瘤病理、腫瘤分子生物學(xué)行為等【3】。腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)、腫瘤藥敏實(shí)驗(yàn)、腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞分離也需要制備腫瘤組織的單細(xì)胞懸液【4】。實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備方法主要有機(jī)械法和酶消化法【6】。機(jī)械法主要是利用研磨法、網(wǎng)搓法和剪碎法。酶消化法常用的酶有：胰蛋白酶和膠原酶。胰蛋白酶對軟組織消化效果較好，膠原酶適合消化含纖維成分較多的組織【4】。酶消化法受酶的種類、濃度、消化時間的影響對細(xì)胞的活性和細(xì)胞表面受體影響較大【5】。近年來，組織分離器越來越多的應(yīng)用于各種組織單細(xì)胞懸液的制備。有研究表明：Medimachine系統(tǒng)可以在短時間內(nèi)完成實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備，樣本可以完全達(dá)到流式檢測的要求【7】。

流式細(xì)胞術(shù)越來越多應(yīng)用于臨床和科研。它作為一種可在單細(xì)胞水平上對大量細(xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、多參數(shù)定量分析和分選的高技術(shù)，在細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等方面的應(yīng)用日趨廣泛和深入【7】。對于實(shí)體組織而言，獲得數(shù)量高、活性好、碎片少的單細(xì)胞懸液是進(jìn)行流式分析的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和前提。實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備，目前無通用方法【8】。需要針對不同組織或不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的制備方法。對于淋巴組織而言，由于淋巴組織含膠原蛋白較少，無論用研磨法還是用組織分離器法，都可以獲得足夠數(shù)量單細(xì)胞。研磨法制備腋窩淋巴組織單細(xì)胞懸液,絲狀物和細(xì)胞團(tuán)塊較多。利用離心、抽提、過濾等實(shí)驗(yàn)方法都難以將絲狀物分離出去。比較而言，利用Gentle MACS組織分離器制備單細(xì)胞懸液有以下優(yōu)點(diǎn)：①操作簡單：只需將取到的新鮮組織標(biāo)本剪碎后放置到C管里面，并按操作說明安放到組織分離器上面即可。②使標(biāo)本的制備過程標(biāo)準(zhǔn)化，減少人為因素對實(shí)驗(yàn)過程影響。③制備單細(xì)胞懸液質(zhì)量較高，活細(xì)胞率較高，絲狀物和細(xì)胞團(tuán)塊的數(shù)量較少，便于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)和流式分析。④單細(xì)胞懸液的制備過程在密閉的系統(tǒng)中進(jìn)行，便于無菌操作，可以大大降低細(xì)胞的污染，為后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)提供無菌保障。

然而，利用Gentle MACS組織分離器制備單細(xì)胞懸液也有其不足之處：該設(shè)備造價較高，普遍應(yīng)用和推廣會受到一定限制。

【1】 譚紅輝，楊偉明，王超宇,等.匯川區(qū)5000例婦女乳腺疾病普查報告【J】.中國婦幼保健，2012,27(14):1310-1311.

【2】 張金梅，余小平，朱小爽,等.流式細(xì)胞術(shù)實(shí)體瘤組織標(biāo)本制備的研究【J】.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2000，8(6)：31.

【3】 董敬朋，陳藝華，張素娟.新鮮腫瘤組織單細(xì)胞懸液的制備方法【J】.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，1995,11(4):280.

【4】 文小崗，金巖，張云漢,等.食管癌單細(xì)胞懸液制備方法比較【J】.河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1997,32(3)：70-71.

【5】 韓亞萍，劉源，李軍，等.肝病患者的肝組織單細(xì)胞懸液與外周血淋巴細(xì)胞亞群的分析比較【J】.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2005,20(5):448-450.

【6】 張召輝，李璽，夏安周，等.移植胰腺組織單細(xì)胞懸液制備方法的比較【J】.2004,3(9):42-43.

【7】 李賓，周春喜.用Medimachine 系統(tǒng)制備實(shí)體組織的單細(xì)胞懸液【J】.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，1999,15(4)：352-353.

【8】 夏安周，邢淑華，朱學(xué)文，等.腎組織單細(xì)胞懸液制備方法的比較【J】.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004,24(1):49-50.

Comparisonofgrindingmethodandtissueseparatorinthepreparationforthesinglecellsuspensionsofbreastcanceraxillarylymphnodes

Chenxiangbiao,Yangweiming,Lujing,Wangchunlin,Tangdan,Hexinyuan,Luolibo,Shilei

(Department of Thyroid-breast surgery,the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo compare the grinding method and Gentle MACS tissue separator in the preparation for the single cell suspensions of axillary lymph nodes in breast cancer and further find a more reliable method for cell culture and flow cytometric analysis of lymphoid tissues.MethodsThe single cell suspensions were prepared using the grinding method and Gentle MACS tissue separator.The numbers of living cells,dead cells,cell clumps and filaments were counted through trypan blue staining to further investigate the advantages and disadvantages of these two methods.ResultsNo significant difference of cell viability between grinding method and Gentle MACS tissue separator was shown.However,compared with the grinding method,fewer filaments and cell clumps were discerned via Gentle MACS tissue separator.ConclusionTissue separator might be better than grinding method in the preparation for lymph node single cell suspensions.

breast cancer;lymph node;single cell suspension

貴州省教育廳重點(diǎn)項目(NO:黔教科(2009)0110)。

楊偉明，男，教授，研究方向：甲狀腺、乳腺和大腸腫瘤，E-mail:yangweiming2004@126.com。

R737.9

B

1000-2715(2012)05-0435-03

【收稿2012-06-12；修回2012-08-28】

(編輯：王福軍)