皮質酮促進大鼠脊髓背角星形膠質細胞糖皮質激素受體表達

肖菊平，田 虹，曾俊偉，肖 智，劉曉紅

(遵義醫(yī)學院 生理學教研室， 貴州 遵義 563099)

皮質酮促進大鼠脊髓背角星形膠質細胞糖皮質激素受體表達

肖菊平，田 虹，曾俊偉，肖 智，劉曉紅

(遵義醫(yī)學院 生理學教研室， 貴州 遵義 563099)

目的觀察皮質酮(CORT)對培養(yǎng)的大鼠脊髓背角星形膠質細胞糖皮質激素受體(GR)表達的影響。方法培養(yǎng)純化新生SD大鼠脊髓背角星形膠質細胞，免疫熒光標記、免疫印跡技術檢測星形膠質細胞GR表達的變化。結果培養(yǎng)的脊髓背角星形膠質細胞均表達GR，CORT可升高星形膠質細胞GR表達。結論藥理劑量的CORT可促進脊髓背角星形膠質細胞GR表達。

皮質酮；糖皮質激素受體；脊髓；星形膠質細胞

糖皮質激素(Glucocorticoid，GC)具有抗炎、抑制免疫反應和膜穩(wěn)定等作用。近年的研究顯示，GC在傷害性信息的傳遞及病理性疼痛時中樞痛敏的形成發(fā)展中也起著重要的作用【1-4】。外周神經損傷時，脊髓背角糖皮質激素受體(glucocorticoid reccptor，GR)表達增加，且GR表達與熱痛敏和機械痛敏的發(fā)展在時間上呈現一致性，鞘內給予GR拮抗劑可明顯減輕神經痛癥狀，表明中樞GR表達促進了病理性神經痛的發(fā)生和發(fā)展【2,5】。

脊髓背角是機體對傷害性信息進行調制和整合的重要位點。新近研究結果表明，脊髓背角星形膠質細胞在病理性疼痛的發(fā)生與維持中起著關鍵作用。在外周神經損傷模型、外周炎性疼痛以及癌痛模型中，均有不同程度的脊髓背角星形膠質細胞活化， 同時伴有胞外K+和Glu濃度升高、脊髓背角感覺神經元興奮性升高【6,7】。神經系統(tǒng)幾乎所有星形膠質細胞均有GR表達，脊髓星形膠質細胞也存在GR表達【8】。近年諸多實驗證實GR參與了星形膠質細胞活性調節(jié)，通過抑制或增強星形膠質細胞活性而參與不同的生理和病理過程【9-11】。然而，影響星形膠質細胞GR表達的因素并不十分清楚。在傷害性刺激等應急狀態(tài)下,機體GC分泌顯著增加，高濃度的GC是否會影響脊髓背角星形膠質細胞GR表達及活性，尚未見報道。本研究采用免疫熒光多重顯色及免疫印跡技術，觀察到培養(yǎng)的脊髓背角星形膠質細胞均有GR表達，皮質酮(corticosterone，CORT)可導致星形膠質GR表達升高。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和器材 1～3 d SD乳鼠，由重慶第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供的成年大鼠 【許可證號SCXK(渝) 2007-0005】 所生；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶為Hyclone 產品；兔源GR抗體、小鼠源膠質纖維酸性蛋白(GFAP) 抗體為美國Santa 公司產品；CORT為美國Sigma公司產品;激光掃描共聚焦顯微鏡 (德國 Leica TCS SP2)；DU-600紫外分光光度計(Beckman，美國)；電泳儀、電泳槽、TRANS-BLOT SD半干電轉移系統(tǒng)(BioRad，美國)。

1.2 方法

1.2.1 脊髓背角星形膠質細胞的培養(yǎng)與鑒定 SD 乳鼠 (<3 d),乙醚麻醉,75%乙醇消毒,解剖顯微鏡下取出脊髓背角組織,1.25 mg/ mL 胰蛋白酶37 ℃培養(yǎng)箱內消化30 min,胎牛血清終止消化,吹打成細胞懸液,接種于75 mL培養(yǎng)瓶內,放置于含5%CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱內。培養(yǎng)10 d 后細胞鋪滿瓶底，傳代兩次后接種在蓋玻片上培養(yǎng)24 h,40 g/ L多聚甲醛固定15 min,0.01 mol/ L PBS 漂洗,加入小鼠源GFAP 單克隆抗體1∶100,37 ℃ 1 h,4 ℃ 過夜后取出,加入山羊抗小鼠IgG (1:200)，37 ℃ 1 h。顯微鏡下觀察GFAP 陽性細胞為星形膠質細胞，GFAP 陽性細胞>98%。

1.2.2 脊髓背角星形膠質細胞GR及GFAP免疫熒光雙重標記 將純化的星形膠質細胞接種于小蓋玻片上,接種密度104個，培養(yǎng)24 h；4%多聚甲醛固定10min,0.01mol PBS 漂洗；加入含兔GR抗體的抗體稀釋液1∶100，37℃孵育2h，4℃過夜； 0.01mol/L PBS 漂洗5 min×3 次,入含有DyLightTM488 標記的山羊抗兔IgG的0.01mol/L PBS(1∶200)中37℃ 1 h；0.01mol/L PBS 漂洗5 min×3 次,入含小鼠GFAP抗體的抗體稀釋液(1∶200)37℃1 h，4℃ 過夜；0.01mol/L PBS 漂洗5 min×3次,入含有DyLightTM594標記的山羊抗小鼠IgG的0.01mol/L PBS(1∶200)中37℃1h； 0.01mol/L PBS 漂洗5 min×3次， DAPI(1∶1000)孵育5min標記所有細胞核DNA，0.01mol/L PBS 漂洗5 min×3次；甘油:PBS = 1∶1 的封片液封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖象。陰性對照以0.01mol/L PBS代替一抗，其余步驟完全相同，注意避光操作。星形膠質細胞核GR表達強度用 Image - Pro Plus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件分析，采集選定細胞核的平均光密度值，進行統(tǒng)計學分析。

1.2.3 免疫印跡技術檢測培養(yǎng)的星形膠質細胞GR蛋白 取生長良好、已融合成片的純化脊髓背角星形膠質細胞，提取各組細胞總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，每孔蛋白上樣量30 μg 行 SDS- PAGE 電泳，半干轉儀將凝膠中的蛋白轉移至 PVDF 膜上，6 %脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗GR多抗(1∶250)，同時加入小鼠抗β-actin單抗(1∶2000)，4℃孵育過夜。PBS 洗膜，加入抗兔HRP-IgG和抗鼠HRP-IgG(1∶2500)，室溫反應1h。加化學發(fā)光顯色試劑，X 射線曝光顯影，β- actin 為內參照，掃描分析軟件系統(tǒng)(LabworksTMAnalysis Software，美國) 分析數據，分析結果以每個條帶的積分光密度(IOD) 值與其相對應的β-actin的IOD值之比表示蛋白的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，兩組間差異比較采用兩獨立樣本的t檢驗,多組均數間差異比較用單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 培養(yǎng)星形膠質細胞的形態(tài)和純度鑒定 倒置相差顯微鏡下見原代培養(yǎng)的脊髓背角星形膠質細胞生長在底層,上層有少突膠質細胞和小膠質細胞生長(見圖1A)。經傳代純化的脊髓背角星形膠質細胞以原漿型為主，呈片狀生長，細胞邊界清楚,胞體扁平,形態(tài)不規(guī)則，核漿界限清楚，胞核呈圓或卵圓形，常位于胞體一側(見圖1B)。GFAP為星形膠質細胞的標志物,用免疫組化方法鑒定培養(yǎng)的細胞中GFAP免疫反應陽性率>98%，表明培養(yǎng)的星形膠質細胞純度高(見圖1C)。

2.2 脊髓背角星形膠質細胞表達GR 免疫熒光雙重染色結合DAPI核標記顯示，幾乎所有培養(yǎng)的脊髓背角星形膠質細胞均表達GFAP (紅色)和GR (綠色)，而在陰性對照細胞只有4',6-diamidino -2-phenylindole(DAPI)核DNA標記藍色熒光。激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察， GR主要表達于星形膠質細胞胞漿和胞核(見圖2)。

2.3 皮質酮對培養(yǎng)脊髓背角星形膠質細胞GR表達的影響 免疫熒光染色結果顯示,不同濃度CORT (0.1μmol/L,1μmol/L,10μmol/L)孵育3 h,脊髓背角星形膠質細胞GR表達增加,尤其是細胞核GR表達增強最為顯著(見圖3) 。對不同濃度CORT作用的星形膠質細胞核進行光密度統(tǒng)計分析，結果顯示，CORT在0.1～10μmol/L，隨著濃度的增加，星形膠質細胞GR表達逐漸增強(P<0.01，見圖4)。 同樣，免疫印跡技術亦檢測到，在1μmol/L CORT作用下，培養(yǎng)的星形膠質細胞GR蛋白量明顯增加(P<0.01，見圖5)。該實驗結果提示，藥理濃度的CORT可促進培養(yǎng)的脊髓背角星形膠質細胞GR表達。

注： A：原代培養(yǎng)的星型膠質細胞； B：傳代純化的星型膠質細胞； C：純化的脊髓背角星形膠質細胞GFAP表達。圖1 培養(yǎng)星形膠質細胞的形態(tài)及純度鑒定

注： A:DAPI標記核DNA;B:GFAP表達;C:GR表達;D:同一視野下A,B,C合并。圖2 免疫熒光雙重染色觀察脊髓背角星形膠質細胞GR表達

注：A:control;B:0.1μmol/L CORT;C:1μmol/L CORT;D:10μmol/L CORT。圖3 CORT導致脊髓背角星形膠質細胞GR表達增高

注：**P<0.01，與對照組比較。圖4 CORT(0.1-10μmol/L)隨著濃度的增加，脊髓背角星形膠質細胞GR表達逐漸增強

注：A:GR蛋白免疫印跡檢測結果； B:免疫印跡檢測GR蛋白表達的統(tǒng)計分析；**P<0.01，與對照組比較。圖5 CORT(1μmol/L)致脊髓背角星形膠質細胞GR蛋白表達增加

3 討論

Yan等通過免疫組織化學技術觀察到，在成年大鼠脊髓星形膠質細胞存在GR表達【8】。本實驗免疫熒光雙重標記檢測表明，幾乎所有體外培養(yǎng)的大鼠脊髓背角星形膠質細胞均表達GR，這為進一步探索GC通過GR調節(jié)脊髓背角星形膠質細胞活性的功能研究提供了形態(tài)學依據。

GC對機體內多種組織和細胞發(fā)揮著廣泛的作用，對神經系統(tǒng)的發(fā)育與分化、神經元的損傷與再生以及突觸可塑性等均有重要的調節(jié)作用。近年的研究顯示， GR參與了痛覺信息的傳導，外周神經損傷時，脊髓背角GR表達增加促進了病理性神經痛的發(fā)生和發(fā)展【2,5】。然而神經病理性疼痛時，究竟哪些因素促進了中樞GR表達變化，并不十分清楚。傷害性刺激導致疼痛時，機體分泌GC顯著增加，高濃度的GC是否會影響脊髓背角星形膠質細胞GR表達尚不清楚。本實驗采用免疫熒光及免疫印跡技術均觀察到，在藥理劑量的CORT作用下，培養(yǎng)的脊髓背角星形膠質細胞GR表達明顯增加，呈現劑量依賴性。GR表達增加能否調節(jié)脊髓背角星形膠質細胞的活性，繼而促進或者抑制星形膠質細胞釋放某些神經遞質如Glu，轉而參與脊髓水平痛覺信息的調制有待進一步研究。

RU38486是糖皮質激素胞漿受體拮抗劑，可阻止糖皮質激素與其胞漿受體的結合。我們前期實驗發(fā)現鞘內給予GR拮抗劑RU38486可明顯減輕坐骨神經慢性壓迫損傷所致的神經痛【12】，RU38486的鎮(zhèn)痛作用是否部分通過脊髓背角星形膠質細胞而發(fā)揮作用尚待進一步研究確定。

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Elevationofglucocorticoidreceptorexpressioninratdorsalspinalcordastrocytesbycorticosterone

Xiaojuping,Tianhong,Zengjunwei,Xiaozhi,Liuxiaohong

(Department of Physiology,Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo investigate the effects of corticosterone -(CORT) on glucocorticoid receptor(GR) expression in cultured rat dorsal spinal cord astrocytes.MethodsAstrocytes from neonatal SD rat spinal cord were cultured and purified.Astrocyte GR expression was detected by immunofluorescence and western blot assay.ResultsImmunofluorescence labeling indicated that GR were shown in most of glial fibrillary acidic protein -(GFAP) positive cultured dorsal spinal cord astrocytes.CORT increased astrocyte GR protein expression.ConclusionCORT could promote GR expression in cultured dorsal spinal cord astrocytes.

corticosterone;glucocorticoid receptor;spinal cord;astrocyte

國家自然科學基金資助項目(NO：30960126)；遵義醫(yī)學院博士科研啟動基金資助項目(NO： 2008)。

劉曉紅,女，博士，教授，研究方向：疼痛生物學機制研究，E-mail:lxh680718@yahoo.com.cn。

R329.27;R338.1

A

1000-2715(2012)05-0367-04

【收稿2012-08-12；修回2012-09-02】

(編輯：譚秀榮)