劉 平
(丹東市食品藥品檢驗所,遼寧 丹東 118002)
諾西肽(Nosihepide)是由活躍鏈霉菌(Streptomyces actuosu)產(chǎn)生的一種含硫多肽類抗生素,分子式為C15H43N13O12S6,屬硫鏈絲菌素(thiostrepton)類[1]。它在體內(nèi)能有效抑制革蘭氏陽性細菌的活性[2]。諾西肽目前主要作為飼料添加劑,優(yōu)點是不被畜禽吸收、在體內(nèi)無殘留,微量加入飼料中就可以提高禽畜的出肉率[2],并可加入魚餌中以防止魚類的壞死性腸炎及加快其生長。國外于20世紀(jì)80年代末批準(zhǔn)上市,目前日本和法國已將其列為法定飼料添加劑。
出發(fā)菌:諾西肽產(chǎn)生菌S.actuosus(由沈陽藥大實驗室提供);鑒定菌:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
亞硝基胍;95%乙醇;糊精;酵母粉;NaCl;CaCO3等
搖床(250r/min);高壓滅菌鍋;超凈工作臺;電子天平;恒溫水??;紫外燈箱(紫外燈15W,照射距離40cm);離心機。
1.4.1 亞硝基胍溶液(NTG)
電子天平精確稱取NTG于無菌試管中,加入微量N,N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解,用適量磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度(現(xiàn)用現(xiàn)配)。
1.4.2 展開劑
氯仿:甲醇:醋酸 = 86:12:2(體積比)
取2ml單孢子懸液于培養(yǎng)皿中,置于紫外燈箱中,在輕微震蕩下照射不同時間,立即避光培養(yǎng)1h,經(jīng)稀釋后涂布培養(yǎng)。
取單孢子懸液于無菌試管中,加入NTG溶液28℃或40℃水浴,經(jīng)稀釋后涂布培養(yǎng)。
取發(fā)酵液以1∶1(V/V)比例加入95%乙醇,37℃浸泡半小時,離心取上清液用生物效價法測定。
圖1 死亡率曲線
圖2 正變率曲線
圖3 死亡率曲線
圖4 正變率曲線
對原始菌株S.actuosus進行自然分離,選擇在連續(xù)傳代下仍有較好產(chǎn)抗能力的S-19作為誘變出發(fā)菌株。
依實驗方法2.1對菌濃為107個/mL的S-19孢子懸液進行不同劑量的紫外線照射處理,以未處理菌液作對照,稀釋涂平皿,生長7天后將對照組與處理組的菌落數(shù)進行比較可得死亡率如圖1所示,不同劑量下的正變率如圖2。
由圖1可知紫外線照射120s死亡率為99.7%,用較大的作用劑量作用該菌仍有存活,可見此菌對紫外線不十分敏感。由圖2可知,在劑量為60秒時正變率最大為19.3%,劑量小于或大于60s正變率均明顯降低。由上得出:紫外線對該菌的誘變最佳劑量為60s。
3.3.1 NTG誘變作用濃度的選擇
依實驗方法2.2對菌濃107個/mL的S-19孢子懸液用不同濃度的NTG溶液水浴處理,以未處理菌液做對照,稀釋涂平皿,生長7d后將對照組與處理組的菌落數(shù)進行比較可得死亡率如圖3所示,不同作用濃度下的正變率如圖4。
由圖2可知當(dāng)NTG的作用濃度為3mg/mL時死亡率為99.99%趨近完全死亡,可見此菌對NTG作用較敏感。由圖3可知,在NTG濃度為時正變率最大為23.2%,濃度小于或大于1mg/mL正變率較低,尤其隨著濃度的加大正變率明顯降低。實驗中發(fā)現(xiàn):濃度過大不僅死亡率很高、正變率降低、負變率明顯增加,而且菌落形態(tài)、產(chǎn)孢子情況、色素顏色、生長速度發(fā)生很大的變化。由上得出:此菌對NTG作用較敏感,較佳的作用濃度為1mg/mL。
3.3.2 NTG誘變的最佳作用條件的選擇
影響NTG誘變作用的因素不僅是NTG的作用濃度,還包括:NTG作用的pH、作用時間、作用溫度等。通過正交實驗可以確定最佳作用條件。正交實驗設(shè)計方案見表1,結(jié)果及分析見表2。
表1 The table of factor and lever
由表2最優(yōu)水平可知,最佳NTG誘變的條件為:在作用濃度為1mg/mL下,NTG溶液pH為6.0(A2)、28℃水?。˙1)、作用時間為1h(C1)。在此條件下進行NTG誘變可得到較高的正變率。另由表2中Rj值可知影響正變率的最顯著的因素為作用溫度(C),其次為作用時間(A),再者是pH值(B)。
由原始菌株S自然分離得到出發(fā)菌株S-19,S-19用紫外線和NTG依次進行誘變,其結(jié)果和誘變譜系見圖5。
由圖5可以看出:通過紫外線、NTG的誘變,自然分離等的手段,最終得到諾西肽產(chǎn)量較高的菌株9-3-17,其諾西肽的產(chǎn)量是出發(fā)菌株S的3倍。
表2 正交實驗及結(jié)果分析表
圖5 Genealogy of nosiheptide producing mutants* Relative Potency
獲得出發(fā)菌株S-19;紫外線對該菌的最佳誘變劑量為60s;NTG對該菌的誘變最佳條件是:作用濃度為1mg/mL,溶液pH為6.0,作用溫度為28℃,作用時間為1h;最終得到誘變菌株9-3-17,其諾西肽的產(chǎn)量是出發(fā)菌株的3倍。
[1]周珮.深層培養(yǎng)諾西肽的初步研究[J].中國抗生素雜志,1990,15(4):308-309.
[2]Claude,P.Identification of Nosiheptide in Feeds and Detection of Residues in Animal Tissue[J].J Asoc Off Anal Chem.,1979,62(5):976-981.