不同年齡驢的后消化道中揮發(fā)性脂肪酸含量和組成的分析初探

陳根元 周小玲，2 蔣 慧，2 唐顯喜 袁亞麗 方 雷，2 肖國亮

(1 塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾843300)(2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾843300)(3 喀什地區(qū)畜牧技術(shù)推廣中心站，新疆 喀什 844000)

揮發(fā)性脂肪酸(VFA)是草食動物消化道中微生物發(fā)酵的主要產(chǎn)物，在以粗飼料為主的家畜中，以VFA 形式提供的能量及營養(yǎng)物質(zhì)具有重要作用。驢為馬科馬屬動物，作為極耐粗飼的單胃草食動物，在飼料消化方面有著與單胃動物和反芻動物不同的特點(diǎn)。驢的消化道前段類似于單胃動物，不同的是，它還具備由盲腸、結(jié)腸和直腸組成［1］的發(fā)達(dá)后腸(hindgut)，后腸是馬屬動物VFA 產(chǎn)生的主要部位，后腸發(fā)酵主要產(chǎn)生以乙酸、丙酸、丁酸等為主的VFA［2，3］，在盲腸中產(chǎn)生的VFA 可滿足馬維持能量需要的30%［4］。馬屬動物對纖維素的消化率可能不遜于反芻動物，Cuddeford 等［5］研究表明驢對纖維的消化比矮種馬更完全。方雷等［6，7］研究也發(fā)現(xiàn)，驢對麥秸、稻草、玉米秸稈和青貯飼料具有良好消化性。

在其它家畜中的研究都證明，飼糧成分尤其是碳水化合物組成無疑是影響后腸VFA 產(chǎn)生的主要因素［8-10］，但馬屬動物的后腸隨年齡而增加，結(jié)腸至少在20 歲時(shí)仍然增加［1］，這種發(fā)育特點(diǎn)說明老齡動物對粗飼料的依賴性增加，推測不同年齡驢的不同消化道部位在VFA 含量及組成方面可能存在某種程度差異，但目前尚未見相關(guān)報(bào)道。此研究主要通過采集不同年齡驢的不同消化道部位食糜液，初步了解年齡和不同腸道部位中VFA的含量及組成特點(diǎn)，以期為深入研究驢后腸營養(yǎng)與代謝生理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及動物

在新疆阿克蘇某驢屠宰場，根據(jù)待驢的年齡及體況，選取幼齡(1～3 歲)、壯年(4～8 歲)和老齡(9～13 歲)的新疆驢作為試驗(yàn)動物。

1.2 儀器設(shè)備及試劑

離心機(jī)(TGL -20A)，氣相色譜儀(GC -2014C，日本島津)，配AT.FFAP 毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 mm×0.25 mm)，氫火焰離子化檢測器(FID)。

乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸標(biāo)準(zhǔn)品(購自Sigma -Aldrich 公司)，氯化汞(分析純)，偏磷酸(分析純)

1.3 樣品采集及處理

待實(shí)驗(yàn)動物屠宰后，取出消化道，鑒別回腸、盲腸、右腹結(jié)腸和右背結(jié)腸部位，回腸食糜采集部位為距回盲端30 cm 至回盲端之間，用拴系法結(jié)扎后，剪開相應(yīng)腸段，收集相應(yīng)腸段內(nèi)容物。

第一期(2011年8～9月)，選擇3 頭幼齡及3頭老齡驢，采集回腸末端、盲腸、右腹結(jié)腸的食糜液，比較前腸與后腸VFA 差異。

第二期(2011年9月)，選取3 頭壯年驢，采集盲腸、右腹結(jié)腸、右背結(jié)腸3 個(gè)部位食糜液，比較后腸不同部位VFA 差異。

第三期(2011年10月～11月)，選取幼齡10頭、壯年17 頭及老齡10 頭共37 頭驢，采集盲腸與右腹結(jié)腸食糜液，調(diào)查不同年齡動物后腸VFA 含量情況。

所有樣品經(jīng)四層紗布過濾后，按10%比例(V/V)添加濃度為25%的磷酸溶液，及數(shù)滴飽和氯化汞溶液，混勻并置于冰盒，待當(dāng)天采樣完成后，置冰箱中于-20℃冷凍保存后分析。

1.4 測定方法

按各VFA 標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間定性，以外標(biāo)法定量。

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備

分別量取不同體積的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸標(biāo)準(zhǔn)品，制成含乙酸1～100 mmol/L，丙酸、丁酸0.5～50 mmol/L，異丁酸、戊酸和異戊酸0.2～20 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液，取1 μL 上述各梯度溶液上機(jī)測試，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表1)。

表1 各VFA 標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.2 樣品制備

樣品解凍混勻后，取10 ml 濾液4 000 rmp 離心15 min，再取上清液2 mL，10 000 rmp 離心15 min，上清液用0.22 μm 水系濾膜過濾后，取1 μL 濾液上機(jī)測定。如峰面積超過上述標(biāo)準(zhǔn)曲線值范圍，則將濾液用去離子水稀釋一倍后再取1 μL 上機(jī)測試。

1.4.3 分析條件

采用程序升溫，初始溫度120℃，保持4 min，后以20℃速率升溫到180℃，保留1 min，整個(gè)程序持續(xù)時(shí)間為8 min。進(jìn)樣口溫度230℃，檢測器溫度230℃。載氣為高純氮?dú)?，色譜柱流量為0.9 mL/min，氫氣流量45 mL/min，空氣流量450 mL/min，分流比30:1，尾吹氣流量30 mL/min。圖1 為某腸道食糜樣品的氣相色譜出峰圖。

圖1 某樣品的氣相色譜出峰圖

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用EXCEL 和SPSS 11.5 軟件進(jìn)行，采用t 檢驗(yàn)(t test)或單因素方差分析(one -way ANOVA)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異顯著，用Duncan 氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示。

表2 幼齡和老齡驢回腸、盲腸與右腹結(jié)腸VFA 含量和比例

2 結(jié)果與分析

2.1 幼齡和老齡驢前、后消化道的VFA 組成

由表2 可知，在VFA 含量方面，幼齡和老齡驢的回腸和盲腸中各VFA 含量無顯著差異(P ＞0.05)，但在右腹結(jié)腸中，除丁酸和異戊酸外，其它VFA 在老齡動物中都顯著高于幼齡動物(P＜0.05)。在幼齡驢中，右腹結(jié)腸乙酸、丙酸、丁酸和總VFA 含量顯著高于回腸(P＜0.05)，但與盲腸無顯著差異(P ＞0.05)，盡管在右腹結(jié)腸中各指標(biāo)數(shù)值高于盲腸;而盲腸的乙酸和總VFA 含量顯著高于回腸(P＜0.05)。在老齡驢中，乙酸、丙酸和總VFA含量顯著高于盲腸和回腸(P＜0.05)，而盲腸除乙酸含量顯著高于回腸(P＜0.05)外，其它各VFA 與回腸間無顯著差異(P ＞0.05)。但需特別說明地是，回腸中各VFA 和總VFA的含量都較低，而盲腸和右腹結(jié)腸VFA 含量個(gè)體間在數(shù)值上變異較大，可能在統(tǒng)計(jì)上掩蓋VFA 在各部位間的差異性，僅就某一個(gè)體值進(jìn)行比較時(shí)，所有個(gè)體均呈現(xiàn)出右腹結(jié)腸和盲腸VFA 含量遠(yuǎn)高于回腸的特點(diǎn)。

在VFA比例方面，幼齡和老齡驢的各腸段中VFA比例無顯著差異(P ＞0.05)。但在幼齡驢的盲腸和右腹結(jié)腸中乙酸比例顯著高于回腸(P＜0.05)，而回腸中丁酸和異戊酸比例顯著高于盲腸和右腹結(jié)腸(P＜0.05)，且在老齡驢中，回腸中戊酸含量顯著高于盲腸和右腹結(jié)腸(P＜0.05);在數(shù)值上，不同年齡驢回腸中異丁酸、異戊酸和戊酸含量高于盲腸和右腹結(jié)腸。另外，在回腸中未檢測出異丁酸。

2.2 壯年驢不同后腸部位VFA 組成

由表3 可知，由于個(gè)體間VFA 含量差異較大，在盲腸、右腹結(jié)腸和右背結(jié)腸中各VFA 含量無顯著差異(P ＞0.05)，但就單一個(gè)體而言，在單個(gè)VFA或總VFA 含量間，總是呈現(xiàn)出盲腸＜右背結(jié)腸＜右腹結(jié)腸的規(guī)律。

就三個(gè)部位各VFA比例來說，各VFA的比例無顯著差異(P ＞0.05)，平均乙酸:丙酸:丁酸的比例約為67:17:8，都是以乙酸為主的發(fā)酵類型，而異丁酸、異戊酸和戊酸比例變化較大。

表3 壯年驢不同后腸部位VFA 含量和比例

2.3 不同年齡段驢盲腸和右腹結(jié)腸VFA 含量及比例

由圖2 和圖3 所示，不同年齡驢個(gè)體間VFA 含量差異很大，將各VFA 含量數(shù)值做成頻次分布圖。同一年齡段驢，在右腹結(jié)腸各VFA 中位于中含量和高含量區(qū)段的比例總是高于盲腸。在不同年齡段盲腸，乙酸、丙酸和異丁酸中位于中和高含量區(qū)段的比例隨年齡增加而增加，而其余VFA 變化無明顯特點(diǎn)。在不同年齡段右腹結(jié)腸，丙酸中位于中和高含量區(qū)段的比例隨年齡增加而增加，而異丁酸中位于中和高含量區(qū)段的比例隨年齡增加而減少，其余VFA 無特定趨勢。

圖2 不同年齡段驢盲腸和結(jié)腸中乙酸、丙酸和丁酸含量頻次分布

圖3 不同年齡段驢盲腸和結(jié)腸中異丁酸、異戊酸和戊酸含量頻次分布

由表4 可知，右腹結(jié)腸中幼齡動物丙酸比例顯著高于壯年動物(P＜0.05)，而壯年組中右腹結(jié)腸異戊酸和戊酸比例顯著高于其盲腸(P＜0.05)，其余各VFA比例無顯著差異(P ＞0.05)。但在盲腸中呈現(xiàn)出乙酸比例隨年齡增加，而丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸比例則隨年齡而降低的趨勢;在結(jié)腸中乙酸和丁酸比例隨年齡而增加。其它VFA 無明顯變化規(guī)律。

表4 不同年齡段驢盲腸與右腹結(jié)腸中VFA比例%

3 討論

在幼齡和老齡驢中，回腸的丁酸、異戊酸和戊酸比例高于盲腸和右腹結(jié)腸，而乙酸比例則較低，且未檢測到異丁酸，表明驢回腸微生物發(fā)酵模式的一些特殊性，但其產(chǎn)生原因及生理功能尚不清楚。

驢盲腸是主要的VFA 產(chǎn)生部位，但從壯年驢中發(fā)現(xiàn)，盲腸中VFA 含量比右腹結(jié)腸和右背結(jié)腸低，其原因是為何呢?從表觀上，我們在采樣過程中發(fā)現(xiàn)，盲腸中食糜液較稀，而右背結(jié)腸較干燥，不易采集食糜液，而右腹結(jié)腸則介于二者之間。按照Frape［1］的報(bào)道，通過回盲結(jié)點(diǎn)的水分中被盲腸腔吸收的比例最多，其次被腹結(jié)腸吸收最多，微生物降解速率在盲腸和腹結(jié)腸中高于背結(jié)腸。從生理上可進(jìn)一步解釋為，盲腸是主要的VFA 產(chǎn)生部位和吸收部位，也是水分吸收重要部位，但盲腸食糜中水分含量仍較多，VFA 被吸收和稀釋，因此VFA 含量低。而右腹結(jié)腸可部分產(chǎn)生VFA，加之進(jìn)一步對水分大量吸收，導(dǎo)致此部位食糜液VFA被濃縮，因而VFA 含量高。而右背結(jié)腸部位，由于食糜水分含量少，已不宜于微生物發(fā)酵產(chǎn)生VFA，但此處VFA 吸收也少，卻對水分有部分吸收，同樣具有濃縮效應(yīng)，導(dǎo)致此處的VFA 含量高于盲腸，但卻比右腹結(jié)腸低。

除個(gè)別部位丙酸、異戊酸和戊酸存在差異外，不同年齡驢的盲腸和右腹結(jié)腸各VFA比例都較接近，表明其發(fā)酵類型和模式基本相同，間接表明大于1 歲驢后腸及其微生物發(fā)酵系統(tǒng)基本完善，這對主要以低質(zhì)粗飼料為食的驢具有特殊的生理意義。徐崇榮［11］對牦牛犢牛瘤胃中VFA 研究發(fā)現(xiàn)，其VFA 總量隨年齡增長而增加，而邵彩霞與韓正康［12］也發(fā)現(xiàn)鵝盲腸中VFA 含量有隨年齡增長而增加的趨勢，Guedes 等［13］研究發(fā)現(xiàn)34～90日齡內(nèi)，年齡顯著地影響家兔盲腸中VFA 含量，但本文結(jié)果說明:大于1 歲齡時(shí)，年齡不是影響驢盲腸和結(jié)腸發(fā)酵的主要因素。但另一方面，老齡驢中右腹結(jié)腸乙酸、丙酸和總VFA 含量高于低齡驢，且盲腸中乙酸比例隨驢年齡增加而增加，表明老齡動物在纖維素利用上更占優(yōu)勢，也說明老齡驢后腸發(fā)育比幼齡動物更加完善。Frape［1］報(bào)道馬屬動物大腸隨年齡增加而增加，結(jié)腸在至少20 歲時(shí)仍然增加，且大腸的末端比始端能在更大的年齡上持續(xù)伸長。這種發(fā)育反映了老齡動物對粗料的依賴增加，也進(jìn)一步說明粗飼料在驢營養(yǎng)供給和后腸發(fā)育中的重要作用。

馬屬動物后腸發(fā)酵與瘤胃的典型區(qū)別是后腸中淀粉含量更低，馬小腸中可高效地消化可溶性淀粉，因此到達(dá)大腸的淀粉較少，除非飼喂大量含淀粉飼糧［1］。馬屬動物大腸食糜內(nèi)容物以結(jié)構(gòu)性碳水化合物為主，乙酸和丁酸是其消化的主要產(chǎn)物，因此，驢后腸都是以乙酸為主的發(fā)酵類型，乙酸摩爾比例約為60～69%，丙酸摩爾比例介于16～23%間，丁酸介于7～11%間，乙酸:丙酸:丁酸比例一般為65:20:10，這3 種VFA 為驢盲腸和結(jié)腸中主要的VFA，占總VFA比例大于90%，異丁酸、異戊酸和戊酸所占比例很小。牛羊瘤胃中乙酸/丙酸比值在3 左右［14，15］，而在驢后腸中普遍大于3，最高者可達(dá)4.3，表明驢后腸乙酸產(chǎn)生量很高，也間接說明其在結(jié)構(gòu)性化合物消化中的重要地位。

孔祥浩等［2］報(bào)道后腸中還含有較高濃度的支鏈脂肪酸，從本文結(jié)果來看，驢后腸中支鏈脂肪酸(異戊酸和異丁酸)比例為5～7%，略高于Bovera等［16］對家兔盲腸的報(bào)道，高于張瑩等［15］對牦牛瘤胃的報(bào)道。異位酸可促進(jìn)纖維分解菌生長［17］，提高纖維的消化率［18］。驢后腸中高比例異位酸可能也對其纖維發(fā)酵具有潛在的益處。

本研究的不足在于未在相同飼糧條件下對試驗(yàn)動物各指標(biāo)進(jìn)行比較，因此不能消除由飼糧引起的差異。李旺［19］總結(jié)發(fā)現(xiàn)，VFA 含量受粗精比的影響較大，而揮發(fā)性脂肪酸組成則受飼料中NDF 和非NDF比例影響較大。Fleming 等［20］研究發(fā)現(xiàn)不同粗料日糧對VFA 含量影響顯著，但VFA比例差異小。在新疆當(dāng)?shù)?，驢飼糧以麥秸、玉米秸為主，這可能是導(dǎo)致驢個(gè)體間VFA 含量差異大而VFA比例接近的主要原因。另外，在屠宰前驢個(gè)體間未進(jìn)食時(shí)間不同，Rérat 等［21］研究表明VFA組成不受禁食時(shí)間所影響，但VFA 含量變化明顯，這可能是引起個(gè)體間VFA 含量差異大的另一個(gè)原因。

4 結(jié)論

4.1 不同年齡和部位，驢個(gè)體間VFA 含量差異較大。就單一個(gè)體而言，回腸中VFA 含量低，而驢后腸VFA 含量高，VFA 含量通常為右腹結(jié)腸＞右背結(jié)腸＞盲腸＞回腸。

4.2 各VFA比例在不同年齡驢的不同后腸部位幾乎都無明顯差異，但回腸各VFA比例與后腸差異較大。在大于1 歲齡驢中，年齡不是影響驢后腸VFA 含量及比例的主要因素，表明大于1 歲齡驢的后腸發(fā)酵系統(tǒng)已經(jīng)基本完善。

4.3 在驢后腸中，微生物發(fā)酵類型為乙酸型，VFA含量及比例以乙酸為主，其次是丙酸和丁酸，也能產(chǎn)生少量的異丁酸、異戊酸和戊酸。

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