生脈飲對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的影響

王敬春 徐 波 張 春

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾衛(wèi)生學(xué)校藥學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161005

生脈飲對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的影響

王敬春1徐 波2張 春1

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾衛(wèi)生學(xué)校藥學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161005

目的 探討生脈飲對(duì)腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factorα，TNF-α）誘導(dǎo)的新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）膠原合成的影響及其機(jī)制。 方法 用不同濃度生脈飲載藥血清與TNF-α處理體外培養(yǎng)的CFs，采用分光光度法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸含量，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測MMP1和TIMP1mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果TNF-α處理組羥脯氨酸含量較空白對(duì)照組明顯升高；與TNF-α組比較，生脈飲口服液血清中羥脯氨酸含量降低。與空白對(duì)照組比較，TNF-α組MMP1和TIMP1mRNA表達(dá)上調(diào)；生脈飲載藥血清組MMP1較TNF-α組顯著升高，而TIPM1顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），并呈濃度依賴性。 結(jié)論 生脈飲對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的CFs膠原合成具有抑制作用，下調(diào)MMP1和上調(diào)TIPM1mRNA表達(dá)可能是其作用的機(jī)制之一。

心肌纖維化；生脈飲；腫瘤壞死因子；膠原合成

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是指在正常心肌組織中膠原纖維過量積聚或膠原成分發(fā)生改變，阻止或逆轉(zhuǎn)纖維化是延緩心力衰竭、減少心律失常發(fā)生的重要手段[1]。MF受多種因素調(diào)控，其中膠原代謝調(diào)節(jié)酶基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor ofmetalloproteinases，TIMPs）的平衡失調(diào)引起的膠原合成增加、降解減少是主要的因素[2]。心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）在MF的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，MF時(shí)CFs增殖并分泌大量膠原蛋白[3]。根據(jù)MF特性，中醫(yī)學(xué)可將心肌間質(zhì)纖維化歸屬于“心痹”范疇，病情發(fā)展可逐步導(dǎo)致“心悸”、“喘證”、“水腫”等[4]。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)MF沒有確切的治療手段，中醫(yī)藥干預(yù)能從多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用，具有一定的優(yōu)勢[5]。生脈飲是中醫(yī)益氣養(yǎng)陰、益心復(fù)脈的著名古方，出自金元時(shí)期張?jiān)厮摹夺t(yī)學(xué)啟源》。本實(shí)驗(yàn)旨在探討生脈飲對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的CFs膠原合成的影響及其機(jī)制，為臨床用藥提供可靠依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生1～3 d Wistar大鼠由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥品與試劑

生脈飲購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司（國藥準(zhǔn)字：Z11020363）；精制胎牛血清購自江海生物高新技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；TNF-α購自北京白鷺園生物技術(shù)有限公司；Trizol RNA提取試劑購自美國 Invitrogen公司；Prime Script RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄與SYBR Premix Ex Taq TMⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司。參照GenBank數(shù)據(jù)庫，采用Primer primer 5.0計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)引物，由Takara公司合成?；蛐蛄腥缦拢篗MP1（擴(kuò)增片段長度 100 bp），F(xiàn)orward Primer為 5′-TTC AGC CAG GCC CAG GTA-3′，Reverse Primer為 5′-TGA GCA GCC ACA CGA TAC AAG T-3′；TIMP1 （擴(kuò)增片段長度 82 bp），F(xiàn)orward Primer為5′-GAG AAG GGC TAC CAG AGC GA-3′，Reverse Primer為5′-TCG AGA CCCCAA GGTATTGC-3′；GAPDH（擴(kuò)增片段長度 134 bp），F(xiàn)orward Primer為 5′-TGG TCTACA TGTTCCAGT ATG ACT-3′，Reverse Primer為 5′-CCA TTT GAT GTT AGC GGG ATC TC-3′。羥脯氨酸試劑盒購自南京建成生物公司。

1.3 儀器

2700 型PCR System擴(kuò)增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品，ABI 7300熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品，UV-2550型紫外分光光度計(jì)為日本島津產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 載藥血清的制備 取SD大鼠，隨機(jī)分為兩組，即空白對(duì)照組及生脈飲組，每組5只。上述兩組大鼠依次分別按生理鹽水 2mL/只和生脈飲 3mL/（kg·d）灌服（相當(dāng)于正常人臨床劑量的6倍）。每日1次，連續(xù)7 d。于第7天上午末次灌服后2 h腹主動(dòng)脈取血。4℃離心取上清，同組血清混合，56℃水浴滅活 30min，-20℃凍存。

2.1.2 CFs分離和培養(yǎng) 無菌條件下開胸取出仔鼠心臟，PBS漂洗，剪成約1mm3碎塊。加入0.25%胰蛋白酶于37℃消化10 min，用含20%胎牛血清的DMEM終止消化，加Hanks液離心收集細(xì)胞。所得細(xì)胞用培養(yǎng)液懸浮，分種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，根據(jù)CFs貼壁速度快的原理，采用差速貼壁法5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)90min，棄上清液，貼壁細(xì)胞即CFs。待CFs生長接近融合時(shí)傳代，實(shí)驗(yàn)采用3～5代細(xì)胞。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組、TNF-α組、TNF-α+空白血清組、TNF-α+5%載藥血清組、TNF-α+10%載藥血清組、TNF-α+20%載藥血清組。細(xì)胞經(jīng)0.125%胰蛋白酶消化后接種于多聚賴氨酸包被的96孔板上，接種密度為1×105細(xì)胞/mL，培養(yǎng)24 h后換無血清培養(yǎng)液同步馴化24 h?？瞻讓?duì)照組給予等體積培養(yǎng)基，TNF-α組給予50 ng/mL TNF-α，TNF-α+空白血清組給予含空白對(duì)照大鼠血清的DMEM添加50 ng/mL TNF-α，各濃度的生脈飲+TNF-α處理組分別給予含5%、10%或20%的生脈飲載藥血清的DMEM同時(shí)添加TNF-α50 ng/mL。共孵育24 h后，收集細(xì)胞。

2.1.4 羥脯氨酸測定 將CFs以4×104細(xì)胞/mL的濃度接種于6孔板中。藥物處理24 h后，收集各組細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。上清液羥脯氨酸含量（mg/L）=（測定管吸光度值-空白管吸光度值）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值-上空白管吸光度值）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度。

2.1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測 實(shí)時(shí)定量PCR檢測CFs MMP1和TIMP1mRNA表達(dá)。用Trizol試劑抽提細(xì)胞總RNA，取2μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Real-time PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增條件為：95℃ 10 s，然后 95℃ 5 s，60℃ 31 s，進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt相對(duì)定量法分析。

2.1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，組間差異用SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 結(jié)果

2.2.1 羥脯氨酸測定 羥脯氨酸含量測定結(jié)果顯示，空白對(duì)照組CFs培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸含量較低，經(jīng)50 ng/mLTNF-α刺激24 h后，羥脯氨酸含量較空白對(duì)照組明顯升高（P＜0.05），表明TNF-α具有促進(jìn)膠原蛋白合成作用。經(jīng)過各濃度的生脈飲載藥血清處理，CFs培養(yǎng)上清中羥脯氨酸含量較TNF-α組明顯減少，并呈濃度依賴性（均P<0.05）。見表1。

表1 生脈飲載藥血清對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的CFs羥脯氨酸含量的影響（，n=6）

表1 生脈飲載藥血清對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的CFs羥脯氨酸含量的影響（，n=6）

注：與 TNF-α組比較，*P<0.05

組別 羥脯氨酸（μg/mL）空白對(duì)照組TNF-α組TNF-α+空白血清組TNF-α+5%載藥血清組TNF-α+10%載藥血清組TNF-α+20%載藥血清組0.92±0.14*2.73±0.28 2.67±0.29 1.97±0.27*1.79±0.22*1.55±0.19*

2.2.2 生脈飲載藥血清對(duì)CFs MMP1 mRNA表達(dá)的影響 MMP1 mRNA在空白對(duì)照組CFs中呈低表達(dá)，經(jīng)50 ng/mL TNF-α刺激24 h后，MMP1表達(dá)代償性增加，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，經(jīng)過3個(gè)濃度生脈飲載藥血清處理后，CFs TIMP1 mRNA表達(dá)較TNF-α組明顯升高，呈濃度依賴性（均P<0.05）。見表2。

表2 生脈飲載藥血清對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的CFs MMP1和TIMP1基因表達(dá)的影響（，2－ΔΔCt，n=5）

表2 生脈飲載藥血清對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的CFs MMP1和TIMP1基因表達(dá)的影響（，2－ΔΔCt，n=5）

注：與 TNF-α組比較，*P<0.05

組別 MMP1 mRNA表達(dá) TIMP1mRNA表達(dá)空白對(duì)照組TNF-α組TNF-α+空白血清組TNF-α+5%載藥血清組TNF-α+10%載藥血清組TNF-α+20%載藥血清組1.05±0.18*2.32±0.25 2.46±0.32 4.20±0.44*4.64±0.37*5.88±0.49*1.02±0.27*3.90±0.42 4.10±0.26 3.40±0.29*2.90±0.33*2.60±0.28*

2.2.3 生脈飲對(duì)CFs TIMP1 mRNA表達(dá)的影響 TIMP1 mRNA在空白對(duì)照組CFs中呈低表達(dá)，經(jīng)50 ng/mL TNF-α刺激24 h后，TIMP1mRNA表達(dá)上調(diào)，與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。3種濃度的生脈飲載藥血清處理后，CFs TIMP1 mRNA表達(dá)較TNF-α組明顯降低，呈濃度依賴性（均P<0.05）。

3 討論

“生脈飲”由人參、麥冬和五味子3藥組成。人參甘溫不燥，具有補(bǔ)氣生津的作用為君藥；麥冬甘寒生津，潤肺養(yǎng)陰，與人參相協(xié)氣陰雙補(bǔ)，相得益彰為臣藥；五味子酸濕收斂，益氣生津，斂陰止汗，既可固氣津之外泄，又能復(fù)氣陰之損耗，與人參、麥冬相輔相成為佐藥?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，人參含有多種人參皂苷，能促進(jìn)造血功能，提高應(yīng)激反應(yīng)能力[6]。麥冬含有多種甾體皂苷，能提高免疫力，抗心率失常和擴(kuò)張外周血管作用[7]。五味子主含揮發(fā)油等，與人參相似的適應(yīng)原樣作用，能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)非特異性刺激的防御能力[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生脈飲載藥血清使CFs培養(yǎng)上清羥脯氨酸表達(dá)量明顯減少，提示在MF形成過程中，生脈飲可通過抑制膠原含量而逆轉(zhuǎn)MF。

MF主要的特征為成纖維細(xì)胞數(shù)目增多和心肌間質(zhì)膠原過度沉積，導(dǎo)致心肌順應(yīng)性下降，心臟舒縮及電傳導(dǎo)功能障礙，是引起心力衰竭的重要原因[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α通過與心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡及引起細(xì)胞外膠原纖維累積，并且激活MMPs，最終也導(dǎo)致心室纖維化、擴(kuò)張及泵功能衰竭。抗TNF-α治療能阻止轉(zhuǎn)基因鼠心肌膠原合成、沉積和變性。心肌過量產(chǎn)生的TNF-α可以引起MF、心力衰竭[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)果顯示TNF-α可以促進(jìn)膠原蛋白合成，誘導(dǎo)MMP1酶降解，增加異常膠原合成，還能夠抑制TIMP1表達(dá)，增加MMP1酶活性，表明TNF-α誘導(dǎo)下的CFs模擬了MF的過程，而生脈飲能逆轉(zhuǎn)TNF-α誘導(dǎo)的CFs膠原蛋白合成增加。

MMP降解細(xì)胞外基質(zhì)成分。MMP-1是最先完成蛋白純化和cDNA克隆的脊椎動(dòng)物膠原酶，以酶原形式合成，通過蛋白水解作用裂解酶原N-端殘基，與其他MMP分享一個(gè)催化區(qū)及一個(gè)序列相似于血紅素蛋白的羧端。在正常成人組織中MMP-1表達(dá)量極少，但在病理情況下如創(chuàng)傷愈合、修復(fù)或重塑過程中，MMP-1表達(dá)量增加[11]。MMP和TIMP處于平衡狀態(tài)，有助于保持動(dòng)脈壁內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)成分合成與降解相互平衡達(dá)到穩(wěn)定作用[12]。正常心臟膠原合成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，合成增加和（或）降解減弱均導(dǎo)致膠原累積。本研究發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組比較，TNF-α組CFs中TIMP1 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05），促使膠原纖維增生，同時(shí)MMP-1 mRNA也代償性升高。與TNF-α組相比較，3個(gè)濃度生脈飲載藥血清處理使CFs中MMP-1mRNA表達(dá)升高 （P<0.05），而TIMP1 mRNA表達(dá)降低?？梢娚}飲可能是通過下調(diào)MMP-1和上調(diào)TIMP1 mRNA表達(dá)水平，從而抑制心肌膠原纖維增生及心肌間質(zhì)纖維化，這可能是其防治心肌纖維化的的作用機(jī)制之一。

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Effect of Shengmai Oral Liquid on TNF-α-induced collagen synthesis in cardiac fibroblasts for rats

WANG Jingchun1 XU Bo2 ZHANG Chun1
1.Department of Pharmacology,Qiqihar Medical College,Heilongjiang Province,Qiqihar 161006,China;2.Pharmacy Teaching and Research Section,Qiqihar Health School,Heilongjiang Province,Qiqihar 161005,China

Objective To explore the effect and mechanism of Shengmai Oral Liquid on collagen synthesis of neonatal rat cardiac fibroblasts(CFs)induced by tumor necrosis factor(tumor necrosis factor α,TNF-α).MethodsCardiac fibroblasts(CFs)were treated with different concentrations of ShengmaiOral Liquid drug-loaded serum plus TNF-αtreatment in vitro.Hydroxyproline content,MMP1 mRNA and TIMP1 mRNA expression were assayed by spectrophotometry and real-time quantitative reverse transcription-PCR,respectively.ResultsThe content of hydroxyproline in cardiac fibroblasts treated with TNF-αwas higher than the control group.The content of hydroxyproline was reduced in Shengmai Oral Liquid drugloaded serum group compared with the TNF-αgroup.MMP1 and TIMP1mRNA expression was up-regulated expression in TNF-αgroups compared with the control group.MMP1mRNA expression was up-regulated and TIMP1 was down-regulated in Shengmai Oral Liquid drug-loaded serum group compared with the TNF-αgroup.ConclusionTheResultsreveal that Shengmai Oral Liquid can inhibit the collagen synthesis in cardiac fibroblasts,and may correlate with down-regulate expression of TIMP1mRNA and up-regulate expression of MMP1mRNA.

Cardiacmuscle fiber;ShengmaiOral Liquid;TNF-α;Collagen synthesis

R541.61

A

1673-7210（2012）12（a）-0024-03

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：12511627）。[作者簡介]王敬春（1974-），男，生物學(xué)碩士，講師；研究方向：心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制和防治策略。

2012-09-05 本文編輯：衛(wèi) 軻）