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    海島棉D(zhuǎn)ELLA蛋白基因GbGAI2的克隆及其在胚珠中表達(dá)分析

    2012-11-10 08:31:42詹杰鵬崔百明彭明曲廷云鄭銀英
    關(guān)鍵詞:海島棉胚珠棉纖維

    詹杰鵬,崔百明,彭明,曲廷云,鄭銀英

    (1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003;2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所,???71101)

    棉花作為棉紡織業(yè)的原材料,與人們的日常生活密切相關(guān),是一種全球性的重要經(jīng)濟(jì)作物,也是我國重要的經(jīng)濟(jì)和戰(zhàn)略物資。海島棉又名長絨棉,其纖維細(xì)長,強(qiáng)力高,紡紗性能極佳,在我國僅在新疆的部分地區(qū)出產(chǎn)長絨棉,產(chǎn)量極為有限。

    赤霉素(Gibberellins,GA)作為一種重要的植物激素,廣泛存在于各種植物中,在調(diào)控胚根的生長、莖桿的伸長、葉片的延展、花的發(fā)育、花器的分化和果實(shí)的成熟等階段發(fā)揮重要作用[1]。棉纖維的發(fā)育可劃分為4個不同且相互重疊的時期:纖維的起始、延伸、次生壁合成以及成熟,而纖維的起始和伸長過程影響棉纖維的產(chǎn)量。棉纖維細(xì)胞的啟動需要激素的刺激,其中赤霉素在誘導(dǎo)單纖維細(xì)胞產(chǎn)生和伸長中具有重要作用[2]

    DELLA蛋白是一類 GRAS(GAI、RGA、SCR)家族蛋白[1],作為GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一類轉(zhuǎn)錄因子,主要起負(fù)調(diào)控作用,抑制GA信號向下游傳遞。在DELLA蛋白的氨基酸序列中,N端同源性總體上不高,但存在DELLA和TVHYNP兩個非常保守的酸性結(jié)構(gòu)域[3]。序列中,N端同源性總體上不高,但存在DELLA和TVHYNP兩個非常保守的酸性結(jié)構(gòu)域[3]。Itoh等[4]利用水稻SLR1基因的突變體分析了DELLA蛋白不同保守結(jié)構(gòu)域的功能,認(rèn)為DELLA與VHYNP是GA信號感知結(jié)構(gòu)域。GA可誘導(dǎo)DELLA蛋白的降解,在水稻GA轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,GA與質(zhì)膜外受體GID1結(jié)合,通過G蛋白或Ca2+以及GID1將信號傳遞到胞內(nèi),誘導(dǎo)DELLA蛋白通過泛素化蛋白酶通道降解,解除DELLA蛋白的抑制作用,進(jìn)而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育[5]。DELLA蛋白結(jié)構(gòu)的完整性為正常GA反應(yīng)所必需,如果DELLA蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使之不能感知GA信號,DELLA蛋白便成為組成性的阻遏蛋白,植株表現(xiàn)出類似GA缺乏的表型[1]。目前,在已發(fā)現(xiàn)的DELLA突變體中,植株大多表現(xiàn)為對GA不敏感的矮化表型。研究表明這些突變體都是因?yàn)镈ELLA蛋白在DELLA區(qū)域發(fā)生了變化,不能感知GA信號,造成DELLA蛋白的積累,從而表現(xiàn)出 GA 不敏感的性狀[1,6-8]。

    近些年來,有關(guān)棉花中DELLA蛋白的研究取得了很大的進(jìn)展。棉花中有4個基因編碼DELLA蛋白的同源基因,分別為 Gh GAI1、Gh GAI2、Gh-GAI3、Gh GAI4,其中已證明 Gh GAI3和Gh GAI4各有2個等位基因GhGAI3a、GhGAI3b、GhGAI4a、Gh GAI4b[9]。預(yù)測海島棉中也存在多個編碼DELLA蛋白的基因。廖文斌等[8]首次從海島棉中克隆得到1個類似DELLA蛋白基因Gh RGL,并證明其包含有DELLA蛋白所有的保守結(jié)構(gòu)域。本實(shí)驗(yàn)克隆了海島棉中DELLA蛋白同源基因GbGAI2,分析了GbGAI2在海島棉胚珠不同發(fā)育階段表達(dá)量的差異。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1材料

    海島棉(Gossiypium barbadense L.)新海14由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院張微教授提供。

    1.1.2試劑

    Taq酶、AMV、DNA回收試劑盒、DNA連接酶、p GEM-Teasy載體等均由Promega公司提供,膜結(jié)合DNA清除試劑盒由北京天恩澤基因科技有限公司提供,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

    1.2 方法

    1.2.1 DNA提取

    取大田中生長3個月的海島棉(新海14)植株幼葉(頂端未展開葉片及向下數(shù)的兩片展開葉)0.5~1.0 g,CTAB法提取海島棉基因組總DNA。

    1.2.2基因克隆

    根據(jù)已知棉花DELLA蛋白Gh GAI2(Gen-Bank登錄號:FJ974045)設(shè)計上游引物:5′-CCCGGGATGAAGCGAGACCACAATCA-3′;

    下游引物:5′-GAGCTCTCACTGGCTTATGGCGGTGG-3′。

    以海島棉基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 程序:94℃5 min后,94℃30 s,66℃45 s,72℃1 min,共35個循環(huán);72℃10 min。PCR產(chǎn)物置于1.5%瓊脂糖中電泳,回收目的片段,回收產(chǎn)物與pGEM-Teasy載體連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂于LB固體培養(yǎng)基(含50μg/m L Amp)上,37℃培養(yǎng)16 h后,挑取菌落,液體LB培養(yǎng)基(含50 μg/m L Amp)37℃震蕩培養(yǎng)12 h后,提取質(zhì)粒DNA,酶切鑒定正確質(zhì)粒DNA送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

    1.2.3序列分析

    利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比較和同源性分析。采用Mega 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,參數(shù)設(shè)置:采取最大簡約法(Maximun Parsimony,MP)構(gòu)建系統(tǒng)樹,隨機(jī)逐步比較的方式搜索最佳系統(tǒng)樹,對生成的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行Bootstrap校正,最終生成系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.2.4胚珠采集

    胚珠采自海島棉開花后第1天(1 DPA)至25天(25 DPA)的棉鈴,隔1 d采集1次,從第8 DPA開始,胚珠上已長出棉纖維,小心分離棉纖維與胚珠組織,收集胚珠。所采集到的胚珠用錫箔紙包好后迅速放入液氮罐中保存,帶回實(shí)驗(yàn)室。

    1.2.5 RNA的提取和cDNA合成

    利用CTAB/酸酚法[10]提取海島棉花后不同發(fā)育時期胚珠組織總RNA,用北京天恩澤基因科技有限公司提供的膜結(jié)合DNA清除試劑盒進(jìn)一步純化海島棉胚珠組織總RNA。

    反轉(zhuǎn)錄采用20μL體系,利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。20μL體系中含1μg總RNA,DEPC水6.5μL,Olig d T 181μL,75℃保溫5 min后,冰上冷卻5 min,然后再依次加入RNase Inhibitor(40 U/μL)0.5μL,5×AMV buffer 4μL,dNTPs(10 mmol/L)2μL和 AMV(5 U/μL)1μL,25℃保溫10 min,42℃溫育60 min,70℃變性5 min,冰浴5 min。所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加EDTA(0.75 mol/L)稀釋至總體積為50μL,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.6半定量RT-PCR

    以海島棉花后不同發(fā)育時期胚珠組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,檢測Gb GAI2基因在海島棉不同發(fā)育時期胚珠中的表達(dá)情況。

    用棉花Gh His3作為內(nèi)標(biāo)基因,Gb GAI2擴(kuò)增引物與內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增引物見表1。

    內(nèi)標(biāo)基因與目的基因同機(jī)分管擴(kuò)增,擴(kuò)增體系中含cDNA(20 ng/μL),10×PCR buffer 2 m L,d NTP(10 mmol/L)1μL,引物(10μmol/L)0.5μL和Taq(5 U/μL)0.2μL,dd H2O 加至總體積20 μL。擴(kuò)增條件為94℃3 min;94℃30 s,58℃45 s,72℃延伸1 min,25個循環(huán),72℃10 min。PCR產(chǎn)物置1.5%瓊脂糖中電泳,用紫外凝膠成像儀(Bio-Rad)觀察結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次。

    表1 半定量RT-PCR引物Tab.1 The primers of Semi-quantitative RT-PCR experiment

    2 結(jié)果與分析

    2.1 GbGAI2基因的克隆與序列分析

    已報道棉花DELLA蛋白基因不含有內(nèi)含子,本研究根據(jù)已知陸地棉D(zhuǎn)ELLA蛋白GhGAI2設(shè)計特異性引物,以海島棉基因組DNA為模板,PCR成功擴(kuò)增得到1條目的片段(圖1)。

    圖1 GbGAI2b基因擴(kuò)增Fig.1 Amplification of the GbGAI2 gene from Gossypium barbadense L.variety of Xinhai 14

    測序發(fā)現(xiàn)該基因片段與陸地棉D(zhuǎn)ELLA蛋白基因Gh GAI2相似性最高,將其命名為GbGAI2。該基因含有1個完整的閱讀框,全長1848 bp,編碼616個氨基酸序列(圖2)。

    將GbGAI2與4個雙子葉植物(陸地棉:DQ006269、FJ974045、HM034760、HM034763、HM034761和 HM034762;擬南芥:CAA72177;葡萄:AAM19210;蕃茄 AAP22369)和3個單子葉植物(水稻:BAA90749.1;小麥:CAB51555;玉米:CAB51557)的已知DELLA蛋白進(jìn)行氨基酸多重序列比較分析(圖2),發(fā)現(xiàn)GbGAI2蛋白具有GRAS家族的所有典型結(jié)構(gòu)域,包括核定位信號域NLS,DELLA蛋白N端保守結(jié)構(gòu)域DELLA和TVHYNP區(qū)域,C端保守結(jié)構(gòu)VHIID、PFYRE和SAW,以及在GA信號傳導(dǎo)過程中起重要調(diào)節(jié)作用的LZ區(qū)域和poly S/T/V 區(qū)域(圖2),由此推測GbGAI2蛋白屬于植物特有的GRAS轉(zhuǎn)錄因子的DELLA亞族,并有可能參與GA信號通路調(diào)節(jié)。

    圖2 海島棉GbGAI2氨基酸序列與已知植物DELLA蛋白氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence comparison of putative GbGAI2 with other related proteins

    對海島棉Gb GAI2與已知植物DELLA蛋白氨基酸序列的相似性進(jìn)行分析(表2),發(fā)現(xiàn)海島棉Gb GAI2與已知植物DELLA蛋白氨基酸序列保守區(qū)高度一致,平均相似性59.14%。其中與陸地棉D(zhuǎn)ELLA蛋白GhGAI2相似性最高,達(dá)到90.13%,其次為葡萄,相似性為69.12%。

    表2 海島棉GbGAI2與已知植物DELLA蛋白相似性比較Tab.2 Identity analysis of amino acid sequence of putative GbGAI2 with other related proteins

    構(gòu)建海島棉GbGAI2與已知植物DELLA蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3),發(fā)育樹中DELLA蛋白主要包括單子葉植物和雙子葉植物。結(jié)合海島棉Gb GAI2與已知植物DELLA蛋白全長氨基酸序列的相似性比較進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)GbGAI2與陸地棉Gh GAI2蛋白氨基酸序列相似性最高,系統(tǒng)發(fā)育樹中處于最近的一個分支,此外,除陸地棉D(zhuǎn)ELLA蛋白GhGAI3a、GhGAI3b、GhGAI4a和GhGAI4b外,海島棉GbGAI2與其他雙子葉植物DELLA蛋白氨基酸序列的相似性普遍高于單子葉植物,在發(fā)育樹中處于一個分支,單子葉植物處于另一個分支。

    圖3 海島棉D(zhuǎn)ELLA蛋白GbGAI2系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of GbGAI2 protein with other related proteins

    2.2 不同時期海島棉胚珠中DELLA基因表達(dá)分析

    棉花纖維形成和發(fā)育過程可分為纖維原始細(xì)胞分化和突起(1-2 DPA)、初生壁伸長(0-25 DPA)、次生壁增厚(20-45 DPA)及脫水成熟(45-50 DPA)4個相互重疊的時期[11]。本研究分析了DELLA蛋白基因GbGAI2在海島棉胚珠不同發(fā)育階段表達(dá)情況。由圖4可見,海島棉D(zhuǎn)ELLA蛋白基因Gb-GAI2在花后胚珠發(fā)育的各個階段均有表達(dá),但不同階段表達(dá)量明顯不同。Gb GAI2在海島棉胚珠發(fā)育的初始階段(1-5 DPA)有高表達(dá)量,之后略有降低,自第9 DPA開始表達(dá)量又有所上升,說明DELLA蛋白GbGAI2可能在棉纖維發(fā)育的起始階段具有重要作用,并對棉花纖維的伸長起到一定作用。待胚珠生長至第23 DPA時,GbGAI2表達(dá)量達(dá)到最高,表明GbGAI2可能參與棉纖維次生壁加厚。

    圖4 海島棉D(zhuǎn)ELLA蛋白基因GbGAI2 1-25DPA胚珠組織的表達(dá)模式Fig.4 The expression level of DELLA gene of Gossiypium barbadense L.in ovule in 1-25DPA

    3 討論

    赤霉素廣泛存在于植物界中,在植物整個生命循環(huán)過程中起著重要的調(diào)控作用[12]。DELLA蛋白在赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起負(fù)調(diào)控作用,DELLA蛋白感知GA信號后通過泛素化通道降解,解除抑制[13]。研究表明DELLA蛋白在赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系中起重要作用,其在赤霉素與其他植物激素互作中的作用也得以闡明[13]。

    本研究成功克隆得到了海島棉D(zhuǎn)ELLA蛋白基因GbGAI2,而且Gb GAI2基因所編碼的氨基酸序列與已知其他物種DELLA蛋白氨基酸序列在保守區(qū)具有很高的一致性,具有GRAS家族蛋白的所有特征結(jié)構(gòu)域,表明GbGAI2編碼的蛋白產(chǎn)物屬于DELLA蛋白家族的一種,很有可能參與海島棉的GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

    比較Gb GAI2與已知DELLA蛋白氨基酸序列的相似性,并結(jié)合DELLA蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)海島棉GbGAI2蛋白與陸地棉D(zhuǎn)ELLA蛋白GhGAI2氨基酸序列相似性最高。除陸地棉Gh-GAI3s、Gh GAI4s外,Gb GAI2與雙子葉植物DELLA蛋白間的相似性普遍高于單子葉植物。Gb-GAI2與陸地棉Gh GAI3a、Gh GAI3b、Gh GAI4a和GhGAI4b間氨基酸序列相似性較低。已有研究結(jié)果表明Gh GAI1與擬南芥5個DELLA蛋白的氨基酸序列相似性為58~64%[8],而 GhGAI3a、Gh-GAI3b、Gh GAI4a和Gh GAI4b與其他物種中DELLA蛋白的相似性為38~40%,具有較大的分歧[9]。

    有關(guān)擬南芥DELLA蛋白的研究表明,DELLA蛋白是GA調(diào)節(jié)下控制編碼毛狀體發(fā)生激活因子基因所必須的,失去功能的GAI對毛狀體發(fā)生有顯著的影響[14]。Yang等[15]對棉花中DELLA蛋白的研究發(fā)現(xiàn),1個DELLA蛋白GAI基因在開花前3 d的表達(dá)量最高,開花當(dāng)天的表達(dá)量有較大幅度的下降,開花后3 d和開花后5 d的表達(dá)量與開花當(dāng)天相比并沒有顯著的改變,而在棉花無毛突變體中相應(yīng)的發(fā)育時期中,GAI的表達(dá)量比野生型棉花均有較大幅度的降低,說明GAI基因在棉纖維發(fā)育的過程中起到重要作用,特別是在起始時期。

    本實(shí)驗(yàn)分析了DELLA蛋白基因GbGAI2在海島棉花后胚珠不同發(fā)育階段表達(dá)量的差異。發(fā)現(xiàn)GbGAI2可能對棉纖維原始細(xì)胞的起始分化以及棉纖維次生壁加厚過程中發(fā)揮作用。本研究為進(jìn)一步弄清楚DELLA蛋白對海島棉棉纖維生長發(fā)育的作用機(jī)制,提供了一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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