食管鱗癌中T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)基因1、血管內(nèi)皮生長因子和CD31的表達(dá)及其相關(guān)性研究

王啟船 王 青 萬里新 屈中玉 盛 晶

河南省南陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南南陽 473009

食管鱗癌中T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)基因1、血管內(nèi)皮生長因子和CD31的表達(dá)及其相關(guān)性研究

王啟船 王 青 萬里新 屈中玉 盛 晶

河南省南陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南南陽 473009

目的 檢測食管鱗癌中T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)基因1（Tiam1）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)特點(diǎn)，關(guān)注其對CD31標(biāo)記的血管生成的作用。 方法 以87例食管鱗癌標(biāo)本作為觀察組，72例正常食管黏膜組織作為對照組，采用流式細(xì)胞技術(shù)，分別檢測二組中Tiam1、VEGF和CD31的表達(dá)，探討其在不同臨床特征中的表達(dá)差別及相關(guān)性。 結(jié)果 Tiam1、VEGF和CD31蛋白在食管鱗癌中高表達(dá)，Tiam1、VEGF和CD31的表達(dá)與食管癌的浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及PCNA的增殖指數(shù)密切相關(guān)；線性相關(guān)性分析顯示Tiam1、VEGF和CD31的表達(dá)之間均呈正相關(guān)性。 結(jié)論 Tiam1、VEGF和CD31在食管鱗癌中高表達(dá)，二者對腫瘤進(jìn)展有重要作用，Tiam1和VEGF可能對促進(jìn)CD31標(biāo)記的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有一定作用，聯(lián)合檢測Tiam1、VEGF和CD31蛋白可能與預(yù)后有關(guān)。

食管鱗癌；T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)基因1；血管內(nèi)皮生長因子；CD31；流式細(xì)胞技術(shù)

食管鱗癌臨床常見，多數(shù)預(yù)后不良，由于其是富于血管的腫瘤，因此其血管生成在腫瘤生長和侵襲中具有重要作用。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異有絲分裂原，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)新生血管的生成，加速腫瘤生長及轉(zhuǎn)移[1]。食管鱗癌是富于血管的腫瘤，其發(fā)生發(fā)展時腫瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá)升高。CD31作為血管內(nèi)皮的重要標(biāo)志物，對新生血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記的特異性強(qiáng)，可以有效地反應(yīng)血管新生的程度。T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)基因1（Tiam1）是一種鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子，特異的激活與Rac相關(guān)的通路，改變腫瘤細(xì)胞形態(tài)和功能，誘導(dǎo)腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[2-3]。本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)，檢測食管鱗癌及正常食管黏膜組織中Tiam1、VEGF和CD31的表達(dá)特點(diǎn)，探討Tiam1、VEGF和CD31的關(guān)系，旨在為探討腫瘤的生物學(xué)行為提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2010年1月～2011年12月食管鱗癌手術(shù)后預(yù)留的新鮮標(biāo)本作為觀察組，標(biāo)本術(shù)后立即取材，置于-80℃冰箱中凍存待檢。納入均符合WHO關(guān)于食管鱗癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理主治醫(yī)師確診。本組患者術(shù)前均未進(jìn)行任何放化療。本組共觀察87例，年齡39～78歲，平均57.7歲，其中男47例，女40例。同時選取距腫瘤邊緣5 cm外的正常食管黏膜組織標(biāo)本72例作為對照組，取材及保存方法同上，本組中男40例，女32例，年齡40～78歲，平均56.9歲，兩組在性別、年齡等相關(guān)因素的比較上差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P>0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑及流式細(xì)胞檢測方法

Tiam1、VEGF和CD31抗體的濃縮液均購自Santa Cruz公司。依不同稀釋比例進(jìn)行預(yù)實驗，選取最佳染色的比例進(jìn)行實驗。將凍存樣本取出，放在75%的酒精中固定24 h后，取出組織放在不銹鋼網(wǎng)上，用剪子搓碎后過濾，制備成單細(xì)胞懸液。取1 mL加入稀釋后的蛋白，嚴(yán)格按實驗要求的時間和順序加入一抗和二抗，經(jīng)銅網(wǎng)過濾后應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行[4]。流式細(xì)胞儀依據(jù)所適應(yīng)的條件調(diào)整相應(yīng)參數(shù)，用系統(tǒng)自帶的軟件進(jìn)行熒光的半定量分析。

1.3結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

采用熒光指數(shù)（FI）表示Tiam1、VEGF和CD31蛋白的表達(dá)量。FI值計算公式為：

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel表格整理，應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計軟件進(jìn)行相關(guān)性檢驗，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tiam1、VEGF和CD31在觀察組與對照組中的表達(dá)

Tiam1、VEGF和CD31在觀察組中的表達(dá)量明顯高于對照組（P<0.05），見表 1。

表1 觀察組與對照組中Tiam1、VEGF和CD31蛋白表達(dá)的比較（±s）

表1 觀察組與對照組中Tiam1、VEGF和CD31蛋白表達(dá)的比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05

組別例數(shù) Tiam1 VEGF CD31觀察組對照組87 72 1.43±0.31*1.00±0.24 1.54±0.28*1.00±0.24 1.44±0.28*1.00±0.25

2.2 Tiam1、VEGF和CD31在觀察組不同臨床特征中表達(dá)的比較

Tiam1、VEGF和CD31的表達(dá)與食管癌的浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及PCNA的增殖指數(shù)密切相關(guān)，見表2。

表2 Tiam1、VEGF和CD31在觀察組不同臨床特征中表達(dá)的比較（±s）

表2 Tiam1、VEGF和CD31在觀察組不同臨床特征中表達(dá)的比較（±s）

臨床病理特征例數(shù) Tiam1 VEGF CD31浸潤深度外膜以內(nèi)外膜及以外P值分化程度高中+低P值淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48 39 1.35±0.24 1.54±0.22<0.05 1.46±0.31 1.64±0.31<0.05 1.36±0.26 1.56±0.32<0.05 47 40 1.35±0.22 1.55±0.21<0.05 1.45±0.28 1.65±0.26<0.05 1.34±0.34 1.56±0.35<0.05無有56 31 P值1.36±0.24 1.54±0.25<0.05 1.47±0.28 1.65±0.26<0.05 1.35±0.38 1.58±0.38<0.05 PCNA表達(dá)<25%≥25%P值52 35 1.34±0.23 1.55±0.29<0.05 1.48±0.22 1.64±0.28<0.05 1.34±0.35 1.58±0.24<0.05

2.3 Tiam1、VEGF和CD31在食管鱗癌中表達(dá)的關(guān)系

經(jīng)Spearman等級線性相關(guān)性分析顯示，觀察組中Tiam1和 VEGF（r=0.45，P=0.013 5）、Tiam1 和 CD31（r=0.41，P=0.036 4）、VEGF 和 CD31（r=0.46，P=0.010 8）的表達(dá)均具有正相關(guān)性。

3 討論

食管鱗癌是實體腫瘤，其生長和轉(zhuǎn)移均依賴于新生血管的形成。血管內(nèi)皮生長因子的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用推動了腫瘤血管生成的研究[5]。食管鱗癌是一種富含血管的惡性腫瘤，血管生成機(jī)制復(fù)雜，并涉及到多種基因和蛋白的作用[6]。CD31是特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，能很好地標(biāo)記腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中形成的新生血管。Tiam1作為Rho蛋白家族重要成員，是Rac1的特異性鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子，能夠催化底物分子中GDP/GTP轉(zhuǎn)換，促進(jìn)GDP的釋放以及與GTP的結(jié)合，進(jìn)而激活Rac1，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重組，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動和遷移，參與基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖與凋亡。其次，Tiaml還可以介導(dǎo)蛋白復(fù)合物的形成以及Tiaml蛋白的細(xì)胞膜的定位，誘導(dǎo)膜皺褶形成，促進(jìn)腫瘤的運(yùn)動功能。再次，Tiaml對Racl蛋白起到明顯的活化作用，并對此通路具有正向調(diào)節(jié)的功能[7-8]。

流式細(xì)胞術(shù)檢測客觀性強(qiáng)，能準(zhǔn)確地反應(yīng)蛋白的表達(dá)程度?；诖耍緦嶒炌ㄟ^流式細(xì)胞術(shù)半定量檢測食管鱗癌中Tiam1、VEGF和CD31的表達(dá)特點(diǎn)，結(jié)果顯示食管鱗癌中Tiam1、VEGF和CD31高表達(dá)，提示三者在腫瘤的發(fā)生中具有重要的促進(jìn)作用；實驗顯示腫瘤中Tiam1、VEGF和CD31的表達(dá)均呈正相關(guān)，即Tiam1、VEGF和CD31可能具有正向協(xié)同作用。Tiam1可能通過Rac通路促進(jìn)VEGF的高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)CD31陽性血管內(nèi)皮細(xì)胞的高表達(dá)，形成腫瘤性的新生血管。Tiam1也可能作為上游基因，直接調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成。Tiam1在誘導(dǎo)VEGF表達(dá)時增加，能明顯增加腫瘤間質(zhì)毛細(xì)血管壁的通透性，起到雙重調(diào)節(jié)血管活性的作用。也有研究顯示，當(dāng)Tiam1引起VEGF的激活后，通過與細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，特異性地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，改變內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)方式，增加微血管的新生[9-10]。本實驗結(jié)果顯示食管鱗癌中Tiam1、VEGF和CD31的表達(dá)與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及PCNA的表達(dá)密切相關(guān)，由于腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及PCNA均與患者的預(yù)后及指導(dǎo)治療相關(guān)，因此提示聯(lián)合檢測三種蛋白的表達(dá)可能對判斷預(yù)后有一定價值。

總之，Tiam1、VEGF和CD31蛋白的高表達(dá)對食管鱗癌的進(jìn)展有重要的促進(jìn)作用，Tiam1可能通過誘導(dǎo)VEGF高表達(dá)促進(jìn)CD31陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞新生，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。聯(lián)合檢測Tiam1、VEGF和CD31的表達(dá)可能與患者的預(yù)后相關(guān)。

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[6]朱宏，施瑞華，凌亭生，等.COX-2、VEGF蛋白在食管鱗癌發(fā)展過程中的表達(dá)變化及其與血管生成的關(guān)系[J].中華消化內(nèi)鏡雜志，2005，22（3）：179-181.

The study of expression of Tiam1,VEGF and CD31 in esophageal squamous cell carcinoma and their correlations of them

WANG Qichuan WANG QingWAN Lixin QU Zhongyu SHENG Jing
Department of Oncology Medical,the Central Hospital of Nanyang City,He′nan Province,Nanyang 473009,China

Objective To detect the expression characteristics of Tiam1 and VEGF in esophageal squamous cell carcinoma,and pay close attention to angiogenesis role with markers of CD31.Methods 87 cases with esophageal squamous cell carcinoma were served as observation group.72 cases with normal esophageal mucosa were served as control group.The expressions of Tiam1,VEGF and CD31 were detected by FCM in the two groups.Their expressive relationship and different pathological characters were analyzed in the esophageal squamous cell carcinoma.Results The expression of Tiam1,VEGF and CD31 were higher in the neoplasm groups than in control group.Their expressions were correlated with invasion,differentiation,metastasis and PCNA expressions.Positive correlation were found between Tiam1,VEGF and CD31 in neoplasm by liner relationship analysis.Conclusion The higher expressions of Tiam1,VEGF and CD31 in esophageal squamous cell carcinama has the important role in tumor progression,and Tiam 1 and VEGF can promote the angiogenesis which expresses CD31 protein.The combined detection of Tiam1,VEGF and CD31 can judge the prognosis of esophageal squamous cell carcinoma.

Esophageal squamous cell carcinoma;Tiam1;VEGF;CD31;FCM

R735.1

C

1673-7210（2012）08（b）-0095-02

王啟船（1975.5-），男，本科，主治醫(yī)師；研究方向：腫瘤內(nèi)科。

2012-03-26 本文編輯：衛(wèi) 軻）