采后硅酸鈉處理對杏果粉霉病的抑制及機(jī)理

王 毅， 趙賓賓， 畢 陽， 葛永紅， 李穎超

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

我國是杏的原生起源中心之一，其果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特、富有營養(yǎng)和保健功效[1-2]。由于杏果采收時正值高溫夏季，加之果實(shí)皮薄多汁，易受機(jī)械損傷和微生物的侵染而發(fā)生腐爛，采后損失頗為嚴(yán)重?；瘜W(xué)殺菌劑雖可有效控制杏果的采后病害[3]，但由于其存在殘留，環(huán)境污染及誘導(dǎo)病原物產(chǎn)生抗藥性等問題而受到限制[4-5]。因此，尋求更為安全有效的防腐措施已十分緊迫。據(jù)報道，硅具有提高植物抗性減輕病害發(fā)生的作用[6]。采后硅酸鈉處理不僅可以有效抑制厚皮甜瓜的的多種采后病害[7-10]，減輕梨采后的黑斑病和青霉病[11-12]，以及馬鈴薯的干腐病[13-14]及柑橘的青霉病[15]；還可提高拮抗酵母Cryptococcus laurentii對采后病害的生防能力[16]。但尚未見硅酸鈉在杏果實(shí)采后病害控制方面的報道。采用硅酸鈉處理杏果實(shí)，觀察處理對果實(shí)粉霉病病原物的體內(nèi)和體外抑制效果，并探討其部分抑制機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試?yán)钚樱≒runus armeniaca cv.Lixing）：采自甘肅省白銀市景泰條山農(nóng)場，紙箱包裝后于采收當(dāng)日運(yùn)抵作者所在實(shí)驗(yàn)室后在常溫（25±2）℃，RH60%～70%下貯藏待用。供試Trichotethium roseum分離自自然發(fā)病果實(shí)，PDA上保存待用。

硅酸鈉（Na2SiO3）：天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心產(chǎn)品，分析純；超凈工作臺：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰技術(shù)有限公司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋：北京廣順科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；UV-2550型紫外分光光度計：日本島津公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 離體試驗(yàn) 參照李云華方法[12]并做修改。將PDA培養(yǎng)基融化后冷卻至45℃，加入用滅菌水配制的硅酸鈉溶液，制備成改良的平板PDA培養(yǎng)基，分別含有 0、6.25、12.50、25 mmol/L 的硅酸鈉。 待培養(yǎng)基冷卻后，將T.roseum菌餅（直徑15 mm）接于培養(yǎng)基中央，25℃避光培養(yǎng)。當(dāng)對照皿中菌體長至培養(yǎng)皿邊緣時，測定病斑直徑并計算抑菌率。每個處理用9個培養(yǎng)皿，重復(fù)3次。

抑菌率 （%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-原菌餅直徑）×100%。

1.2.2 果實(shí)處理 選擇外觀整齊，無病蟲的果實(shí)。配制不同濃度的硅酸鈉溶液（0、25、50、75 mmol/L），加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%Tween-80作為表面活性劑，浸泡果實(shí) 10 min，取出晾干，在常溫（23±2）℃、RH85%～95%條件下貯藏待用。

1.2.3 果實(shí)的損傷接種 參照畢陽方法[17]并做修改。以清水處理為對照，在處理后24 h進(jìn)行接種試驗(yàn)。接種時，先用體積分?jǐn)?shù)70%酒精擦拭果實(shí)表面進(jìn)行消毒，再用滅菌鐵釘在果實(shí)表面等距離刺孔3個（深3 mm，直徑2 mm），1.5 h后用微量移液器向每孔中注入 10 μL （1×106cfu/mL）粉紅單端孢（T.roseum）孢子懸浮液。 在常溫 （23±2）℃、RH85%～95%條件下貯藏。4 d后利用十字交叉法測量病斑直徑。每處理用果10個，重復(fù)3次。

1.2.4 硅酸鈉對杏果實(shí)粉霉病的誘導(dǎo)時效 用1.2.3篩選出的最佳濃度處理果實(shí)，并用清水處理做對照。分別于硅酸鈉溶液處理后的第24，48，72，96 h，進(jìn)行損傷接種，方法同1.2.3。于接種4 d后利用十字交叉法測量病斑直徑。每處理用果10個，重復(fù)3次。

1.2.5 生化指標(biāo)測定

1）取樣 用1.2.3篩選出的最佳濃度處理果實(shí)，以清水處理做對照。分別于處理后24，48，72，96 h取果實(shí)赤道部位陰陽兩側(cè)皮下 3 mm果肉組織或果皮組織，錫箔紙包裹，液氮冷凍后，低溫（-80℃）保存待測。每個處理用果實(shí)10個，重復(fù)3次。

2）過氧化物酶（POD）活性測定 參照李合生[18]的愈創(chuàng)木酚法并修改。酶活性以470 nm處，3 min反應(yīng)體系光密度的變化0.01為1個活性單位（u），酶活性單位以 U/（g·Fw）表示。

3）多酚氧化酶（PPO）的活性測定 參照 Chen et al[19]方法并作修改。酶活性以每分鐘吸光度變化0.01 為 1 個活性單位（u），酶活性單位以 U/（g·Fw）表示。

4）總酚和類黃酮含量的測定 參照Pirie和Mullins的方法測定[20]。1 g果皮組織，與10 mL的1%HCL-甲醇在冰浴條件下充分研磨，然后在8 000 r/min，4℃的條件下離心10 min，取上清液直接用于比色。重復(fù)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel2003計算標(biāo)準(zhǔn)偏差并作圖，并用DPS7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行Duncan’s多重差異顯著分析。圖中豎線代表標(biāo)準(zhǔn)誤，相同字母表示差異不顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體條件下硅酸鈉對T.roseum的抑制

離體條件下，硅酸鈉可明顯抑制T.roseum菌絲的生長，抑制效果隨硅酸鈉濃度增加而增強(qiáng)。當(dāng)濃度為25 mmol/L時，處理者120 h后的菌落直徑僅為對照的三分之一（圖 1（A））。 此外，25 mmol/L處理120 h后抑菌效果也最好，抑菌率可達(dá) 85%，其次為 12.5 mmol/L 處理 （圖 1（B））。

圖1 In vitro條件下不同濃度硅酸鈉對粉霉病菌落直徑（A）和抑菌率（B）的影響Fig.1 Effect of sodium silicate at different concentrations on colony diameter of T.roseum （A）and its inhibitory rate（B）in vitro

2.2 不同濃度硅酸鈉對李杏粉霉病病斑直徑和誘導(dǎo)持續(xù)時間的影響

硅酸鈉處理可有效抑制杏損傷接種T.roseum病斑直徑的擴(kuò)展（圖2（A））。隨著濃度的增加，抑制效果逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到50 mmol/L時，處理者的病斑直徑低于對照15%。更高濃度處理未進(jìn)一步提高抑制效果，但也未對果實(shí)造成藥害。50 mmol/L處理后間隔24，48，72 h損傷接種T.roseum果實(shí)的病斑直徑均能顯著降低，但處理后96 h損傷接種處理果實(shí)的病斑直徑反而大于對照（圖2（B））。由此表明，50 mmol/L硅酸鈉處理誘導(dǎo)了杏果實(shí)的抗性，且誘導(dǎo)時間可持續(xù)72 h。

2.3 硅酸鈉處理對果實(shí)抗性酶活性的影響

硅酸鈉處理明顯增強(qiáng)了果實(shí)體內(nèi)的POD和PPO的活性，在處理后96 h內(nèi)處理與對照的POD和PPO的活性均呈先上升后下降趨勢，但其間處理者的活性均高于對照（圖3）。處理者得POD和PPO的活性和對照相比均在72 h時差異達(dá)到最大，分別高出對照的76%和19%。

圖2 不同濃度硅酸鈉（A）和50 mmol/L硅酸鈉處理間隔不同時間接種（B）對損傷接種果實(shí)病斑直徑的影響Fig.2 Effecton lesion diameter ofsodium silicate concentration （A）or the time interval between application of odium silicate at 50 mmol/L and wound inoculation with T.roseum（B）in apricot fruit

圖3 硅酸鈉處理對貯藏過程中果實(shí)POD（A）和PPO（B）活性的影響Fig.3 Effect of sodium silicate treatment on activities of POD（A）and PPO（B）in apricot fruit

2.4 硅酸鈉處理對果實(shí)總酚和類黃酮含量的影響

硅酸鈉處理可明顯提高果實(shí)體內(nèi)總酚的含量，在貯藏過程中，對照和硅酸鈉處理的果實(shí)總酚含量呈先升高后降低趨勢（圖4（A））。在第48 h到96 h，處理者的總酚含量均高于對照。在72 h時差異達(dá)到最大，約為對照的1.06倍。隨著貯藏時間的延長，對照和硅酸鈉處理的果實(shí)體內(nèi)類黃酮含量都保持相同的趨勢，并且處理的含量始終高于對照，但差異不明顯（圖 4（B））。

圖4 硅酸鈉處理對杏果實(shí)總酚（A）和類黃酮（B）含量的影響Fig.4 Effect of sodium silicate treatment on the content of total phenolics（A）and flavoniods（B）in apricot fruit

3 結(jié)語

研究結(jié)果表明，采后硅酸鈉處理可以有效減輕杏果實(shí)的粉霉病，其作用與硅酸鈉直接抑制病原物的生長和誘導(dǎo)果實(shí)抗性相關(guān)[9]。離體條件下硅酸鈉對T.roseum菌落的生長的抑制，與其改變培養(yǎng)基的pH，損害病原物質(zhì)膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一些功能物質(zhì)泄漏有關(guān)[15]。前期試驗(yàn)觀察到，硅酸鈉可明顯堿化培養(yǎng)基的pH，當(dāng)硅酸鈉處理濃度為6.25～25.0 mmol/L時，培養(yǎng)基的pH會由中性猛增至10～11。 在 硅 酸 鈉 抑 制 Pencillium.digitatum[15]，Alternaria alternata，F(xiàn)usarium semitectum[9]的 生 長 試驗(yàn)中也觀察到類似的結(jié)果。

硅酸鈉處理后間隔不同時間對果實(shí)損傷接種的結(jié)果表明，硅酸鈉處理誘導(dǎo)了杏果實(shí)體內(nèi)的抗病性，但誘導(dǎo)的效果與處理劑量和處理與損傷接種間隔時間密切相關(guān)。據(jù)報道，多種防御酶和抗菌物質(zhì)在產(chǎn)品的抗病性反應(yīng)中具有積極的作用。POD和PPO活性，以及總酚和類黃酮含量是指示果實(shí)抗病性是否被誘導(dǎo)的重要生化指標(biāo)[21]。POD參與了木質(zhì)素的合成和酚類物質(zhì)的聚合[22-23]，以及細(xì)胞壁的生長和交聯(lián)化反應(yīng)[24]，從而提高了細(xì)胞壁的抗病能力。在寄主-病原物互作中，酚類物質(zhì)被認(rèn)為與抗病性密切相關(guān)，它可以在PPO的作用下氧化成對病原菌具有很高毒性的醌類物質(zhì)，直接抑制病原菌對植物的侵染[19，25]。作者研究觀察到處理果實(shí)的POD、PPO活性及總酚含量增加，表明硅酸鈉處理激活了果實(shí)體內(nèi)的抗性生化反應(yīng)，提高了果實(shí)的抗病性。在硅酸鈉處理梨的試驗(yàn)中也觀察到類似的結(jié)果[12]。類黃酮作為植物保衛(wèi)素，具有抑制真菌孢子萌發(fā)、芽管伸長、菌絲生長及毒害菌絲末端細(xì)胞的作用[26]。但作者研究未能發(fā)現(xiàn)處理果實(shí)中有類黃酮的顯著積累，可能與硅酸鈉處理形成的堿性環(huán)境抑制了果實(shí)中類黃酮的積累有關(guān)[27]。

硅酸鈉對杏果實(shí)粉霉病的的抑制可能還涉及苯丙烷代謝、活性氧代謝、病程相關(guān)蛋白等其它的防衛(wèi)機(jī)制，以及硅在果實(shí)表面的機(jī)械屏障作用等方面?？紤]到硅在地球表面分布的廣泛性以及硅處理的安全性，硅處理將有望成為一種新的防腐技術(shù)。

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