CD34+CD38－Lin－細(xì)胞群單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的初步研究

韓有金，齊軍元，邱錄貴

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 血液學(xué)研究所 血液病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300020

干細(xì)胞是近年來醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)之一，其中很大一部分研究成果集中在造血干細(xì)胞。干細(xì)胞的重要特性是具有自我更新能力、較強(qiáng)的增殖能力以及多向分化潛能［1］。這些生物學(xué)特性的維持和生物學(xué)行為的發(fā)生依賴于一些關(guān)鍵的信號(hào)通路，如 Hedgehog［2］、BMP［3］、Notch［4］通路。這些信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子在造血干細(xì)胞中的作用一直是研究人員關(guān)注的重點(diǎn)。本研究在單個(gè)CD34+CD38-Lin-細(xì)胞水平上分別就上述通路的一些關(guān)鍵信號(hào)分子如Shh、BMP-4、Jagged-1對(duì)于CD34+CD38-Lin-細(xì)胞群體的自我更新、增殖擴(kuò)增、定向分化的影響進(jìn)行研究。

材料和方法

材料與試劑足月健康新生兒臍帶血6份，每份100 ml，經(jīng)產(chǎn)婦及家屬書面同意用于本研究。淋巴細(xì)胞分離液，密度1.073 g/ml;Lin-磁珠分離試劑盒、Mini MACS分離器、LS和MS分離柱 (德國Miltenyi Biotec公司)，7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)細(xì)胞凋亡染色試劑盒 (以色列FERMENTEK公司)，鼠抗人CD34和CD38，流式細(xì)胞儀 (美國BD公司)，干細(xì)胞培養(yǎng)基、人造血干細(xì)胞甲基纖維素培養(yǎng)基MethoCult H4434(StemCell公司)。

CD34+CD38－Lin－細(xì)胞分選取足月健康新生兒臍帶血，分離出其中的干細(xì)胞即CD34+CD38-Lin-細(xì)胞，具體步驟簡述如下:經(jīng)Fincoll分離得到單個(gè)核細(xì)胞，然后經(jīng)免疫磁珠法先分離出其中的Lin-細(xì)胞群，再分離出上一步中所得細(xì)胞的CD34+細(xì)胞群，最終得到CD34+CD38-Lin-細(xì)胞群。用流式細(xì)胞術(shù)分析所得細(xì)胞的存活率及細(xì)胞純度。

單個(gè)CD34+CD38－Lin－細(xì)胞生存能力檢測取分離后的CD34+CD38-Lin-細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀將其以單個(gè)形式加入到事先加好干細(xì)胞培養(yǎng)基的96孔板中。按照加入細(xì)胞因子的不同，以Shh、BMP-4、Jagged-1作為實(shí)驗(yàn)組，未添加細(xì)胞因子的以等量PBS作為對(duì)照組。1周內(nèi)在倒置熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的存活及增殖情況。

單個(gè)CD34+CD38－Lin－細(xì)胞增殖能力檢測取分離后的CD34+CD38-Lin-細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀將其以單個(gè)形式加入到事先加好干細(xì)胞培養(yǎng)基的96孔板中。按照加入細(xì)胞因子的不同，以BMP-4、Jagged-1作為實(shí)驗(yàn)組，未添加細(xì)胞因子的以等量PBS作為對(duì)照組。1周后計(jì)數(shù)各組細(xì)胞的每孔細(xì)胞數(shù)。

單個(gè)CD34+CD38－Lin－細(xì)胞集落形成分析用流式細(xì)胞儀將分離后的CD34+CD38-Lin-細(xì)胞以單個(gè)形式加入到事先加好甲基纖維素培養(yǎng)基的96孔板中。按照加入細(xì)胞因子的不同，以BMP-4、Jagged-1作為實(shí)驗(yàn)組，未添加細(xì)胞因子的以等量PBS作為對(duì)照組。1周后觀察計(jì)數(shù)各組細(xì)胞形成紅系爆式集落形成單位 (erythroid colony-forming unit，BFU-E)、粒系集落形成單位 (granulocyte colony-forming unit，CFU-G)、單核細(xì)胞系集落形成單位 (macrophage colony-forming unit，CFU-M)、粒單系集落形成單位(granulocyte macrophage colony-forming unit，CFU-GM)等各式集落的情況。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理單個(gè)臍血CD34+CD38-Lin-液體培養(yǎng)7 d后，計(jì)數(shù)有活細(xì)胞的培養(yǎng)孔數(shù)，并計(jì)算有活細(xì)胞培養(yǎng)孔中的活細(xì)胞平均數(shù)。

結(jié) 果

CD34+CD38－Lin－細(xì)胞群的分離用7-AAD陰性和側(cè)向角 (side scatter，SSC)兩個(gè)參數(shù)設(shè)門，以免流式細(xì)胞儀分選到死亡細(xì)胞 (圖1A);再用流式細(xì)胞儀分選CD34+CD38-Lin-細(xì)胞 (圖1B)。

培養(yǎng)1周內(nèi)單個(gè)CD34+CD38－Lin－細(xì)胞的生存及倍增在培養(yǎng)第3天，各組均能看到單個(gè)CD34+CD38-Lin-細(xì)胞的分裂倍增現(xiàn)象;而在第7天能看到細(xì)胞進(jìn)一步增殖 (圖2)。培養(yǎng)7 d后，計(jì)數(shù)每份臍帶血來源CD34+CD38-Lin-對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組有活細(xì)胞的培養(yǎng)孔，計(jì)算有活細(xì)胞孔占第0天接種了細(xì)胞的培養(yǎng)孔的比率。第2份臍血來源CD34+CD38-Lin-細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)現(xiàn)Shh組有活細(xì)胞孔比率雖然高于對(duì)照組，但低于BMP-4和Jagged-1組 (圖3)，故在后4份臍帶血來源CD34+CD38-Lin-細(xì)胞的培養(yǎng)中去掉了Shh組。

培養(yǎng)1周后干細(xì)胞的增殖培養(yǎng)1周后，計(jì)數(shù)各組每孔細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算各組平均每孔的細(xì)胞數(shù)，對(duì)照組為5.465個(gè)細(xì)胞/孔，BMP-4組為6.295個(gè)細(xì)胞/孔，Jagged-1組為6.784個(gè)細(xì)胞/孔。每孔細(xì)胞數(shù)量的柱形分布圖顯示實(shí)驗(yàn)組中每孔細(xì)胞數(shù)量為0的孔數(shù)明顯低于對(duì)照組，尤其是Jagged-1組，而實(shí)驗(yàn)組每孔細(xì)胞數(shù)量多于17的孔數(shù)高于對(duì)照組，其中BMP-4組最高 (圖4)。

圖1 流式細(xì)胞儀分選CD34+CD38-Lin-細(xì)胞群的設(shè)門過程Fig 1 Gating of viable CD34+CD38-Lin-cells

圖2 培養(yǎng)1周內(nèi)單個(gè)CD34+CD38-Lin-細(xì)胞的生存及增殖情況Fig 2 Single CD34+CD38-Lin-cell viability and proliferation from one culture well

圖3 培養(yǎng)1周后各組細(xì)胞的存活率Fig 3 Survival rates of wells with vital cells for each sample of umbilical cord blood after one-week liquid culture

圖4 培養(yǎng)1周后具有一定數(shù)量活細(xì)胞孔占有活細(xì)胞孔比率的柱形分布圖Fig 4 Percentage distribution of wells with certain number of viable cells out of total wells with viable cells

細(xì)胞集落形成經(jīng)集落形成培養(yǎng)1周后，發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞均能形成包括 BFU-E、CFU-G、CFU-M、CFU-GM的各式集落 (圖5)。但是每孔細(xì)胞均只能形成一種集落。實(shí)驗(yàn)組的每孔集落數(shù)明顯高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組之間的差異并不明顯 (圖6)。

圖5 培養(yǎng)1周后CD34+CD38-Lin-細(xì)胞形成的各式集落Fig 5 Colonies formed by cell(s)after liquid culture of 1 week from single CD34+CD38-Lin-cell initially seeded

圖6 CD34+CD38-Lin-細(xì)胞液體培養(yǎng)1周后形成的集落數(shù)Fig 6 Total number of colonies formed by CD34+CD38-Lincells after 1-week liquid culture

討 論

通常認(rèn)為，干細(xì)胞的命運(yùn)的主要是由干細(xì)胞龕或說是其所處的微環(huán)境決定的，這個(gè)微環(huán)境主要包括一些周圍基質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞本身所分泌的細(xì)胞因子和生長因子等［5］。早在 1978 年，Schofield［6］就發(fā)現(xiàn)脾臟來源的造血細(xì)胞的增殖能力比骨髓中的造血干細(xì)胞顯著下降，因而提出了干細(xì)胞龕理論，認(rèn)為干細(xì)胞的干細(xì)胞性，即自我更新能力和定向分化能力依賴于干細(xì)胞龕，干細(xì)胞龕能精確調(diào)節(jié)真正干細(xì)胞和定向祖細(xì)胞的平衡。其后不斷有研究人員通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)該理論［7-10］。干細(xì)胞的自我更新、增殖擴(kuò)增以及定向分化需要微環(huán)境的調(diào)節(jié)［11-12］，并且與多種細(xì)胞信號(hào)通路有關(guān)［13］。但最近有研究表明干細(xì)胞在不依賴微環(huán)境的單細(xì)胞狀態(tài)下也能向多系分化［14］，說明其內(nèi)部因素也發(fā)揮了非常重要的作用。

為了探討造血干細(xì)胞的自我更新、增殖與分化在多大程度上依賴于體內(nèi)的微環(huán)境，或者細(xì)胞本身的遺傳因素是否更為重要，本研究分離培養(yǎng)新生兒臍帶血中被證明含有造血干細(xì)胞的CD34+CD38-Lin-細(xì)胞群體［15］，通過在不同條件的培養(yǎng)體系中進(jìn)行單細(xì)胞水平的培養(yǎng)和集落形成實(shí)驗(yàn)，來研究造血干細(xì)胞的生物學(xué)特性。

本研究從新生兒臍帶血中成功分離出CD34+CD38-Lin-細(xì)胞群，流式細(xì)胞術(shù)檢測表明其活性很好，純度也比較高，保證了進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)的可靠性。

隨后利用流式細(xì)胞儀將所分離的CD34+CD38-Lin-細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，且每天觀察其生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的第3天，不管是空白對(duì)照組還是分別加入了相同濃度的細(xì)胞因子Shh組、BMP-4組和Jagged-1組，都出現(xiàn)了細(xì)胞的分裂增殖現(xiàn)象。而培養(yǎng)1周后計(jì)數(shù)，細(xì)胞進(jìn)一步增殖變多，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量普遍明顯多于對(duì)照組，說明含有造血干細(xì)胞的CD34+CD38-Lin-細(xì)胞群的增殖并不完全取決于外部微環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)部的遺傳因素在其中起決定性作用;而實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)量普遍較多，說明微環(huán)境尤其是細(xì)胞信號(hào)通路分子確實(shí)對(duì)于CD34+CD38-Lin-細(xì)胞(含有造血干細(xì)胞)的生存及自我更新有重要作用。

接下來的單細(xì)胞水平的集落形成實(shí)驗(yàn)則是為了研究CD34+CD38-Lin-細(xì)胞的分化能力與微環(huán)境及其自身內(nèi)部遺傳因素的關(guān)系。經(jīng)集落形成培養(yǎng)1周后，本研究發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞都能形成包括BFU-E、CFU-G、CFU-M、CFU-GM在內(nèi)的各式集落，但每孔細(xì)胞均只能夠形成一種集落。這個(gè)結(jié)果可能由兩方面的原因所導(dǎo)致:一方面可能是分離得到的CD34+CD38-Lin-細(xì)胞群中沒有具有干細(xì)胞性的造血干細(xì)胞，而僅僅包含已經(jīng)定向的祖細(xì)胞;另一方面可能是造血干細(xì)胞在單細(xì)胞水平下分裂增殖時(shí)喪失了干細(xì)胞性，所得到的子代細(xì)胞均為定向祖細(xì)胞，只具有單能性，不具有全能性。而要保持干細(xì)胞的生物學(xué)特性，則必須由外部信號(hào)分子和細(xì)胞內(nèi)部分子相互作用，需要干細(xì)胞與外部微環(huán)境進(jìn)行交流，從而調(diào)控干細(xì)胞的自我更新和增殖分化的平衡。這種可能性最近被 Sarrazin 等［16］和 Rieger等［17］的研究所證實(shí)。

總之，造血干細(xì)胞的生物學(xué)特性與微環(huán)境關(guān)系非常密切;其內(nèi)部的遺傳機(jī)制對(duì)造血干細(xì)胞的存活與增殖起決定性作用，外部因素起到促進(jìn)作用，微環(huán)境中的細(xì)胞因子尤其是信號(hào)分子能極大提高干細(xì)胞的存活和增殖能力，干細(xì)胞生物學(xué)特性的保持尤其是全能性的保持嚴(yán)重依賴于與外界微環(huán)境的信息交流。本研究結(jié)果對(duì)白血病的治療有一定的啟示作用，白血病干細(xì)胞有可能依賴于微環(huán)境實(shí)現(xiàn)自我更新而保持干細(xì)胞性，因此治療應(yīng)針對(duì)其存活的微環(huán)境，從切斷其與微環(huán)境的信息交流入手。

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