不同入肝血流阻斷方式對(duì)大鼠肝切除術(shù)后肝再生的影響

王鵬飛，李崇輝，張愛(ài)群，蔡守旺，董家鴻

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院肝膽外科 全軍肝膽外科研究所，北京100853

肝臟是全身唯一的有兩套供血系統(tǒng)的器官，其中門靜脈供血占70%～80%，肝動(dòng)脈占20%～30%，正常情況下肝竇內(nèi)血供主要來(lái)源于門靜脈，當(dāng)門靜脈阻斷時(shí)，靜脈竇內(nèi)血流顯著降低甚至難以測(cè)到，而阻斷肝動(dòng)脈時(shí)，肝血竇內(nèi)仍保留80%的血流［1］。目前大多外科醫(yī)生進(jìn)行肝臟手術(shù)時(shí)為減少離斷肝實(shí)質(zhì)時(shí)的出血量，采用肝蒂三聯(lián)阻斷 (occlusion of portal triad，OPT)法 (即Pringle法)，但該法不可避免會(huì)對(duì)剩余肝臟造成缺血再灌注損傷，從而影響患者的愈后［2］。同時(shí)，筆者臨床觀察發(fā)現(xiàn)，采用保留肝動(dòng)脈的入肝血流阻斷方法同樣能達(dá)到較好的止血效果。本研究組之前的動(dòng)物研究也證實(shí)該方法可以大大減輕肝臟缺血再灌注損傷［3］。但是該方法與傳統(tǒng)Pringle手法對(duì)肝再生的影響鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以不阻斷入肝血流單純切除大鼠68%肝臟為對(duì)照組，對(duì)比研究傳統(tǒng)的OPT法與保留肝動(dòng)脈單純門靜脈阻斷(occlusion of portal vein，OPV)法對(duì)大鼠肝切除術(shù)后肝再生的影響。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性Wistar大鼠，體重240～260 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。自由飲水，隨意進(jìn)食，12 h照明，適應(yīng)環(huán)境1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

動(dòng)物模型的建立

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:采用經(jīng)尾狀葉轉(zhuǎn)流門靜脈血流阻斷模型，按Higgins法切除大鼠68%肝臟，根據(jù)阻斷方式將健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組、OPT組和OPV組。

手術(shù)操作:術(shù)前12 h禁食，不禁水。用10%水合氯醛按3 ml/kg劑量腹腔內(nèi)注射麻醉。仰臥位固定后碘伏消毒，取上腹正中切口約1.5～2.0 cm入腹，充分顯露肝區(qū)結(jié)構(gòu)，離斷肝周韌帶，以顯微外科方法分離出擬阻斷血管。OPT組:為避免腸道淤血干擾研究結(jié)果，選擇經(jīng)尾狀葉轉(zhuǎn)流門靜脈血流阻斷模型［4］:用小號(hào)動(dòng)脈夾分別阻斷肝左、右葉肝蒂 (約占全肝95%)，造成受累肝葉缺血，保留尾狀葉(約占全肝5%)血供，作為門靜脈血液經(jīng)肝臟回流入下腔靜脈的通道。OPV組:兩個(gè)血管夾分別只阻斷肝左葉、右葉肝蒂內(nèi)門靜脈，達(dá)到預(yù)定阻斷時(shí)間后去除阻斷夾。OPT組和OPV組達(dá)到預(yù)定阻斷時(shí)限后按照Higgins法切除68%肝臟，對(duì)照組不阻斷血流，僅切除68%肝臟，保證每只大鼠總的手術(shù)時(shí)間均為60 min。生理鹽水灌洗切除肝臟后稱取肝臟濕重W1，分層連續(xù)縫合關(guān)腹。術(shù)中腹腔補(bǔ)充5 ml溫?zé)嵘睇}水，術(shù)后電熱毯保溫到蘇醒，自由進(jìn)食水。

標(biāo)本收集及處理觀察3 d、7 d兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)保證至少8只大鼠存活。

肝組織放射性活度:每只大鼠二次開(kāi)腹后于下腔靜脈注射0.3 ml藥盒法標(biāo)記的99Tcm-GSA，放射量約37 MBq(高锝酸鈉注射液購(gòu)自原子高科有限公司，GSA購(gòu)自北京師宏藥物研制中心)。注射后15 min斷頭處死，取出肝臟，生理鹽水灌洗后稱得重量W2，并在放射性活度計(jì) (CRC-25R，美國(guó)CAPINTEC INC.)內(nèi)測(cè)量其放射性計(jì)數(shù)N，放射性活度=N/W2［5］。用10%福爾馬林溶液固定標(biāo)本，石蠟包埋，切片后免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

肝再生度:每只大鼠術(shù)后均稱取肝臟濕重W1，根據(jù)切除肝臟占整體肝臟68%，算得大鼠原肝臟重量W0=W1/0.68，二次手術(shù)時(shí)切取全部肝臟后稱重W2，肝再生度=(W2-W0×0.32)/W0×100%。

增殖細(xì)胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen，PCNA)標(biāo)記指數(shù):石蠟切片按照說(shuō)明書(shū)以PCNA單抗 (DAKO公司)進(jìn)行免疫組化染色，以聯(lián)苯二氧胺顯色，甲基綠復(fù)染。本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性染色信號(hào)呈棕黃色。PCNA標(biāo)記指數(shù)以每例在光鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)高倍視野 (×400)中至少1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)的PCNA陽(yáng)性核的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示 (陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/計(jì)數(shù)的肝細(xì)胞總數(shù)×100%)。

Ki-67標(biāo)記指數(shù):石蠟切片按照說(shuō)明書(shū)以Ki-67單抗 (abcam公司)進(jìn)行免疫組化染色，以聯(lián)苯二氧胺顯色，甲基綠復(fù)染。本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性染色信號(hào)呈棕黃色。Ki-67標(biāo)記指數(shù)以每例在光鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)高倍視野 (×400)中至少1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)的Ki-67陽(yáng)性核的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示 (陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/計(jì)數(shù)的肝細(xì)胞總數(shù)×100%)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

安全阻斷時(shí)限Higgins法切除大鼠肝臟之前，各組入肝血流阻斷時(shí)間分別為20、30、40 min時(shí)，OPT組術(shù)后7 d的存活情況為5/5、3/5、0/5，OPV組術(shù)后7 d的存活情況為5/5、4/5、3/5。阻斷40 min后行肝切除術(shù)，術(shù)后1周內(nèi)OPV組生存率明顯高于OPT組。考慮到大鼠生存率，將后續(xù)實(shí)驗(yàn)的阻斷時(shí)限設(shè)定為30 min。

肝再生度各組大鼠肝切除術(shù)后肝再生度結(jié)果顯示:3 d和7 d兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)，OPV組術(shù)后肝再生度與對(duì)照組接近，兩組均高于OPT組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(表1)。

放射性活度各組大鼠術(shù)后3 d及7 d放射性活度結(jié)果顯示:術(shù)后第3天，對(duì)照組和OPV組的肝組織放射性活度均大于OPT組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);術(shù)后第7天，各組之間放射性活度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(表1)。

肝細(xì)胞PCNA標(biāo)記指數(shù)各組大鼠術(shù)后3 d及7 d PCNA標(biāo)記指數(shù)結(jié)果顯示:術(shù)后第3天，對(duì)照組和OPV組的PCNA標(biāo)記指數(shù)均大于OPT組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＜0.01);而對(duì)照組和OPV組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。術(shù)后第7天，對(duì)照組、OPV組和OPT組之間的PCNA標(biāo)記指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(表1)。免疫組化染色結(jié)果見(jiàn)圖1。

再生肝臟Ki-67標(biāo)記指數(shù)各組大鼠肝切除術(shù)后3 d及7 d Ki-67標(biāo)記指數(shù)結(jié)果顯示:術(shù)后第3天，對(duì)照組Ki-67標(biāo)記指數(shù)大于OPT組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);OPV組Ki-67標(biāo)記指數(shù)亦大于OPT組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);且對(duì)照組和OPV組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。術(shù)后第7天，對(duì)照組、OPV組和OPT組之間的Ki-67標(biāo)記指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(表1)。免疫組化染色結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 各組大鼠術(shù)后剩余再生肝臟PCNA免疫組化染色結(jié)果 (×400)Fig 1 Immunohistochemistry of residual liver for PCNA in each group after hepatectomy(×400)

表1 各組大鼠肝切除術(shù)后肝再生度、再生肝臟的放射性活度、PCNA標(biāo)記指數(shù)和Ki-67標(biāo)記指數(shù) (±s)Table 1 Liver regeneration rate，radioactivity，and PCNA and Ki-67 labeling index in each group following hepatectomy(±s)

表1 各組大鼠肝切除術(shù)后肝再生度、再生肝臟的放射性活度、PCNA標(biāo)記指數(shù)和Ki-67標(biāo)記指數(shù) (±s)Table 1 Liver regeneration rate，radioactivity，and PCNA and Ki-67 labeling index in each group following hepatectomy(±s)

與 OPT組比較，aP＜0.05，bP＜0.01aP ＜0.05，bP ＜0.01 compared with OPT group

肝再生度Liver regeneration rate(%)放射性活度Radioactivity(MBq/g)PCNA標(biāo)記指數(shù)Ki-67標(biāo)記指數(shù)組別Group 術(shù)后7 d 7 days after術(shù)后7 d 7 days after術(shù)后7 d 7 days after術(shù)后7 d 7 days after術(shù)后3 d 3 days after hepatectomy hepatectomy術(shù)后3 d 3 days after hepatectomy hepatectomy對(duì)照組Gontrol group 46.4± 7.4 77.0±14.9 0.949±0.090a 1.070±0.067 62.4±6.7b 14.6±3.5 45.5±7.4b 6.8±2.7 OPT組OPT group 40.0± 6.9 65.8±14.2 0.719±0.087 0.985±0.061 52.3±3.9 14.2±2.9 32.5±9.7 5.5±2.8 OPV組OPV group 47.1±10.5 73.0±13.5 0.855±0.056a 1.005±0.088 59.4±4.6b 13.2±3.0 41.6±8.6a hepatectomy PCNA labeling index術(shù)后3 d 3 days after hepatectomy hepatectomy Ki-67 labeling index術(shù)后3 d 3 days after hepatectomy 6.5±3.8

圖2 各組大鼠術(shù)后剩余再生肝臟Ki-67免疫組化染色結(jié)果 (×400)Fig 2 Immunohistochemistry of residual liver for Ki-67 in each group after hepatectomy(×400)

討 論

肝臟是一個(gè)血供豐富的內(nèi)臟器官，肝切除過(guò)程中肝創(chuàng)面出血是影響手術(shù)及術(shù)后患者恢復(fù)的重要因素［6］。自1908年P(guān)ringle提出通過(guò)阻斷肝蒂的入肝血流來(lái)減少肝臟手術(shù)出血的方法后，研究者們又提出多種改良方法，很大程度上提高了肝臟手術(shù)的安全性，促進(jìn)了復(fù)雜肝臟手術(shù)的開(kāi)展。然而，這些阻斷方法不可避免會(huì)對(duì)剩余肝臟造成缺血再灌注損傷［2］。正常情況下，肝動(dòng)脈提供肝臟50%以上的供氧量，有研究表明肝動(dòng)脈有較高的壓力梯度，能充分灌流肝臟血管網(wǎng)絡(luò)的每一個(gè)角落，門靜脈阻斷時(shí)盡管入肝血流量大大降低，但是通過(guò)測(cè)定組織氧分壓，發(fā)現(xiàn)肝動(dòng)脈依然可以滿足肝組織代謝所需氧分［7］。筆者通過(guò)臨床觀察發(fā)現(xiàn)，手術(shù)中保留肝動(dòng)脈單純阻斷門靜脈同樣能達(dá)到較好的止血效果，并且可以一定程度上延長(zhǎng)連續(xù)阻斷時(shí)間，避免了Pringle手法反復(fù)阻斷開(kāi)放而增加的手術(shù)時(shí)間和開(kāi)放等候時(shí)增加的無(wú)益出血量，且術(shù)后患者恢復(fù)良好，未出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥。本研究所前期的動(dòng)物研究采用相同的分組方法，比較了血生化指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶，氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛、過(guò)氧化物歧化酶，細(xì)胞能量代謝指標(biāo)Na-K-ATP酶以及HE染色病理切片，結(jié)果顯示保留肝動(dòng)脈的入肝血流阻斷方法緩解了由于阻斷肝門血流而引起的肝細(xì)胞能量匱乏，可穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞損傷，大大減少了剩余肝臟的缺血再灌注損傷［3］。肝臟再生能力是肝部分切除術(shù)后肝功能恢復(fù)的關(guān)鍵因素，本研究的著眼點(diǎn)即對(duì)比不同入肝血流阻斷方式對(duì)肝再生的影響。

評(píng)價(jià)肝再生的方法有很多，肝再生度表示再生肝重占原肝重的百分率，在一定程度上能較好地反映再生肝臟的增長(zhǎng)情況，是一種較直觀、簡(jiǎn)單的方法［8］。此外免疫組織化學(xué)方法具有簡(jiǎn)單、迅速，且能保持組織結(jié)構(gòu)完整性等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛重視，本實(shí)驗(yàn)采用了國(guó)內(nèi)外研究通用的PCNA和Ki-67兩個(gè)肝再生指標(biāo)，PCNA在細(xì)胞周期的S期高峰表達(dá)，Ki-67則在M期高峰表達(dá)，同時(shí)觀察上述兩項(xiàng)指標(biāo)，可以較客觀地反映肝再生情況［9-10］。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，雖然各組在術(shù)后3 d、7 d兩時(shí)相點(diǎn)上肝再生度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在術(shù)后第3天，OPV組PCNA標(biāo)記指數(shù)和Ki-67標(biāo)記指數(shù)顯著高于OPT組，且與單純切肝對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在保留肝動(dòng)脈的入肝血流阻斷方法下行肝切除術(shù)后，雖然在重量和體積方面還沒(méi)有體現(xiàn)出相對(duì)于完全阻斷組的明顯優(yōu)勢(shì)，但早期 (3 d)核蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示殘肝肝細(xì)胞增殖活躍，更有利于術(shù)后肝再生及早期恢復(fù)。

正如臨床上經(jīng)常碰到的問(wèn)題一樣，肝臟的體積大小并不總能代表肝臟功能的好壞，功能性肝再生也不完全同步于體積性肝再生［11］。近些年來(lái)，99Tcm-GSA越來(lái)越多地被用于評(píng)估肝臟功能的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床工作。其機(jī)制是GSA可以與僅在哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞表面表達(dá)的去唾液酸糖蛋白受體特異性結(jié)合［12］。日本及國(guó)內(nèi)的多個(gè)研究表明，在肝炎、肝硬化或肝癌等肝損傷性疾病發(fā)生時(shí)，哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞膜上的去唾液酸糖蛋白受體數(shù)量和活性均受到損害，肝臟組織的放射性活度均降低［5，13］。本研究結(jié)果顯示術(shù)后第3天，OPV組肝臟的放射性活度明顯高于OPT組，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明OPV組肝臟細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體數(shù)量更多，即功能性肝體積要優(yōu)于OPT組。這提示在肝切除手術(shù)中，采用保留肝動(dòng)脈血供的入肝血流阻斷方法在減少缺血再灌注損傷的同時(shí)更有利于剩余肝臟早期再生，相比臨床常用的Pringle法有較大的優(yōu)勢(shì)。

總之，保留肝動(dòng)脈入肝血流阻斷法肝切除組相比完全入肝血流阻斷組，術(shù)后早期雖然肝臟再生度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是再生核蛋白表達(dá)顯著增加，功能性肝體積亦顯著增大，且與不阻斷對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示保留肝動(dòng)脈減輕缺血再灌注損傷的同時(shí)也有利于術(shù)后早期剩余肝臟再生。這或許提示在臨床工作中，保留肝動(dòng)脈血供的入肝血流阻斷法是一個(gè)值得推廣的更好的肝血流阻斷方法。

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