基于ITS2條形碼的五加皮基原植物及其易混品的鑒定△

曾旭，李秋實，王鈐，謝麗芳，張亞蘭，羅焜，劉志華，3*

（1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193；2.中國藥科大學，江蘇 南京 210089；3.南京林業(yè)大學，江蘇 南京 210037；4.中國醫(yī)學科學院信息中心，北京 100730；5.北京城市學院生物醫(yī)藥學部，北京 100083）

基于ITS2條形碼的五加皮基原植物及其易混品的鑒定△

曾旭1，2，李秋實1，王鈐1，謝麗芳4，張亞蘭5，羅焜1，劉志華1，3*

（1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193；2.中國藥科大學，江蘇 南京 210089；3.南京林業(yè)大學，江蘇 南京 210037；4.中國醫(yī)學科學院信息中心，北京 100730；5.北京城市學院生物醫(yī)藥學部，北京 100083）

目的：對五加皮基原植物及其易混品進行分子鑒別，為臨床用藥提供科學依據(jù)。方法：從GenBank數(shù)據(jù)庫下載五加皮基原植物及其易混品的ITS2序列，經CodonCode Aligner，MEGA4.0等軟件進行序列拼接和分析，構建NJ（鄰接）、ME（最小進化）樹，并應用Koetschan等建立的ITS2數(shù)據(jù)庫及其網站預測ITS2二級結構輔助分析。結果：基于ITS2序列的兩種系統(tǒng)聚類樹都易于將五加皮基原植物細柱五加與其易混品鑒別開；比較與細柱五加親緣關系較近的同屬易混品二級結構可以看出，細柱五加在螺旋區(qū)莖環(huán)的數(shù)目、大小、位置以及螺旋臂由中心環(huán)伸出時的轉角等方面，與其易混品間具有較明顯區(qū)別。結論：ITS2序列可以將五加皮基原植物及其易混品區(qū)分開，在藥用植物基原鑒定方面具有重要應用價值。

五加皮；DNA條形碼；ITS2；分子鑒定

五加皮為五加科五加屬植物細柱五加Acanthopanax gracilistylusW.W.Smith的干燥根皮［1］，具有收斂固澀，益氣生津，補腎寧心等功能［2］。五加皮用藥歷史悠久，地方習用品種較多，混用現(xiàn)象較為嚴重。易混品主要有五加科植物糙葉五加A.henryi、紅毛五加A.giraldii，蘿藦科植物杠柳Periploca sepium［3］。此外還有五加科植物剛毛五加A.simonii、白簕花A.trifoliatus、無梗五加A.sessiliflorus、刺五加A.seticosus、多蕊木Tupidanthus calyptratus，茄科植物枸杞Lycium chinense、寧夏枸杞L.barbarum，茜草科植物牛白藤Hedyotis hedyotidea等［4-14］。由于正品與易混品之間單靠傳統(tǒng)鑒別方法鑒定存在較大難度，所以本研究采用DNA條形碼技術，以目前倍受關注的ITS2序列片段為條形碼［15-23］標準，對五加皮基原植物及其多種易混品進行DNA條形碼鑒別研究，建立該藥材的分子鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

所用ITS2序列均從GenBank數(shù)據(jù)庫下載，詳見表1。

表1 五加皮基原植物及其易混品樣本來源表

1.2 數(shù)據(jù)分析

樣本數(shù)據(jù)使用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法進行分析，去除兩端5.8S和26S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列。對包括五加皮基原植物與其易混品的17條ITS2序列使用CLUSTALX軟件進行序列比對分析，并用MEGA 4.0軟件對結果進行種內、種間遺傳距離的計算。計算基于Kimura 2-Parameter（K2P）雙參數(shù)模型，用 NJ鄰接法（Neighbour-2-Joining Method，NJ）和最小進化法（Minimum Evolution，ME）將比對過的序列構建成系統(tǒng)發(fā)育樹（1000次重復bootstrap檢驗各分支的支持率）以直觀鑒定各物種［24］。最后，使用德國Koetschan等［25］建立的 ITS2網站 http：//its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/cgi-bin/index.pl預測 ITS2二級結構。

2 結果與分析

2.1 序列比較

五加皮基原植物細柱五加的ITS2序列長度為230 bp，具有一個Poly C結構和一個Poly A結構，GC含量分別為62.2%，五加皮基原植物與其主要易混品ITS2序列間存在較多的變異位點，根據(jù)Kimura 2-parameter（K2P）參數(shù)遺傳距離模型計算得到的序列間遺傳距離，種間平均K2P距離為0.371。與細柱五加遺傳距離最遠的為杠柳，距離值為0.675，距離最近的為剛毛五加，距離值為0.028。

2.2 聚類分析

基于ITS2序列，通過鄰接法（NJ）所構建的系統(tǒng)聚類樹圖（圖1）可以看出，五加科植物和其中的五加屬（Acanthopanax）植物分別都聚集為一枝，支持率為100%和93%，而細柱五加的不同樣本數(shù)據(jù)聚在一枝，支持率為93%，并且枝長較短，表現(xiàn)出單系性。與其他同屬植物，包括紅毛五加，無梗五加，刺五加，剛毛五加，白簕花，以及與其同科植物多蕊木，都能由分枝的枝長和支持率的不同，明顯區(qū)分而鑒別開來。此外，杠柳的3個樣本數(shù)據(jù)相聚為一枝，與細柱五加差別非常明顯。枸杞和寧夏枸杞聚集為一枝，牛白藤獨自為一枝，與細柱五加區(qū)別明顯。

基于ITS2序列構建的五加皮基原植物及其易混品的最小進化樹（ME）（圖2）與鄰接法（NJ）所構建的系統(tǒng)聚類樹對比可以反映出，細柱五加的4個樣本都聚集為一枝，枝長較短，都支持了單系性的特點。對比結果還反映出，利用ITS2序列來鑒別五加皮基原植物與其易混品，無論與正品親緣關系遠近，都有很好的鑒別效果。

圖1 基于ITS2序列構建的五加皮基原植物及其易混品的鄰接（NJ）樹

圖2 基于ITS2序列構建的五加皮基原植物及其易混品的最小進化樹（ME）

2.3 五加皮基原植物及其主要易混品ITS2序列二級結構

從五加皮基原植物與其主要易混品ITS2二級結構比較可以看出，主要差異位于螺旋（Helix）Ⅰ區(qū)和Ⅲ區(qū)，表現(xiàn)在莖環(huán)（Loop）的數(shù)目、大小、位置以及螺旋臂由中心環(huán)伸出時的轉角，不同物種間有或多或少的區(qū)別。如圖3所示，細柱五加二級結構螺旋Ⅰ頂部存在2個小莖環(huán) （Loop）相距較遠，而刺五加和杠柳2個物種二級結構螺旋Ⅰ頂部的莖環(huán)在大小及位置上均與細柱五加存在明顯區(qū)別。細柱五加二級結構螺旋Ⅲ的莖環(huán)在數(shù)量、大小及位置與其他物種也存在明顯不同。此外，細柱五加二級結構螺旋Ⅱ頂部的莖環(huán)在數(shù)量、大小及位置與無梗五加區(qū)別較大，因此，ITS2二級結構也可作為輔助鑒別手段。

圖3 五加皮及其易混品的ITS2二級結構比較

3 討論

ITS2作為DNA條形碼序列，可以有效地將五加皮基原植物與其易混品區(qū)分開。ITS2二級結構用于親緣關系較近的同屬易混品的鑒定，可以直觀地區(qū)分五加屬的多種植物，鑒別五加皮的易混品種［26-29］。同時，由鄰接（NJ）法構建的系統(tǒng)聚類樹和最小進化樹（ME）皆可以看出，細柱五加的4種不同樣本都單獨聚集為一枝，支持率分別達到93%和78%，并且枝長較短，體現(xiàn)出較強的單系性，說明了細柱五加與其他易混品種極易區(qū)分。此外，在兩種聚類圖中，五加屬植物聚集為一枝（支持率＞93%）；五加科植物聚為一枝（支持率皆為100%）。以上證據(jù)說明不同屬、不同科的植物，利用ITS2作DNA條形碼序列，能夠非常準確地區(qū)分開來。有文獻報道，五加屬植物、多蕊木屬植物親緣關系較近，亦有人曾提出 “五加屬可能起源于多蕊木屬”的論點［30］，從本研究結果也可以看出五加屬植物與多蕊木屬植物具有密切的親緣關系。綜上所述，ITS2作為DNA條形碼序列不僅能區(qū)別五加皮基原植物與其易混品，同時，對于探討五加屬的分類學關系亦能起到重要的參考價值。

［1］國家藥典委員會.中國藥典［S］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：61.

［2］王惠民.《神農本草經》中五加皮考釋［J］.中藥材，1999，22（1）：43-45.

［3］王會如.《中國藥典》2005年版一部中易混淆中藥飲片品種解析［J］.首都醫(yī)藥，2008，（2）：19-20.

［4］倪娜，劉向前，張曉丹.8種五加屬植物根皮中五加酸和貝殼烯酸的RP-HPLC法定量分析［J］.中南大學學報（自然科學版），2009，40（5）：1216-1221.

［5］劉克武，于洋.刺五加AFLP分子標記技術體系的建立［J］.中國林副產，2010，（6）：1-3.

［6］陳婉花.地骨皮、五加皮、香加皮三者不可混用［J］.海峽藥學，2006，18（6）：67-68.

［7］劉志友.紅毛五加、刺五加、五加皮及香加皮的區(qū)別［J］.實用中醫(yī)藥雜志，2008，24（6）：402.

［8］張曉.南五加與北五加的區(qū)別［J］.實用中醫(yī)藥雜志，2007，23（11）：740.

［9］代萍，傅光輝.五加皮、香加皮和刺五加鑒別［J］.實用中醫(yī)藥雜志，2009，25（1）：43.

［10］王竹金，陳登奏.五加皮、易混品香加皮及刺五加的鑒別［J］.海峽藥學，2005，17（4）：110.

［11］謝素萍.五加皮與其混淆品的鑒別［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2009，11（1）：162.

［12］唐薇冬.五加皮與香加皮不可互為代用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17（9）：1738-1739.

［13］王連山.五組混用中藥的鑒別［J］.山東中醫(yī)雜志，1995，11（1）：29.

［14］陳俊華.中藥香加皮與五加皮的鑒別［J］.黑龍江中醫(yī)藥，2005，（6）：48.

［15］Chinese Plant BOL Group.Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer（ITS）should be incorporated into the core barcode for seed plants［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108：19641-19646.

［16］Li D.，Liu J.，Chen Z.，etal.Plant DNA barcoding in China［J］.Journal of Systematics and Evolution，2011，49（3）：165-168.

［17］陳士林，龐曉慧，姚輝，等.中藥DNA條形碼鑒定體系及研究方向［J］.世界科學技術—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2011，13（6）：747-754.

［18］陳士林，宋經元，姚輝，等.藥用植物DNA條形碼鑒定策略及關鍵技術分析［J］.中國天然藥物，2009，7（5）：322-327.

［19］陳士林，姚輝，宋經元，等.基于DNA barcoding（條形碼）技術的中藥材鑒定［J］.世界科學技術—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007，9（3）：7-12.

［20］陳士林，蘇鋼強，鄒健強，等.中國中藥資源可持續(xù)發(fā)展體系構建［J］.中國中藥雜志，2005，30（15）：1141-1146

［21］羅焜，陳士林，陳科力，等.基于蕓香科的植物通用DNA條形碼研究［J］.中國科學，2010，30（4）：342-351.

［22］朱英杰，陳士林，宋經元，等.重樓屬藥用植物DNA條形碼鑒定研究［J］.藥學學報，2010，45（3）：376-382.

［23］Alvarez I，Wendel J F.Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference［J］.Mol Phylogenet Evol，2003，29（3）：417-314.

［24］Chen S.，Yao H.，Han J.，et al.Validation of the ITS2 Region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species［J］.PLoSONE，2010，5（1）：e8613.

［25］Koetschan C.，F(xiàn)?rster F.，Keller A.，etal.The ITS2 Database III-sequences and structures for phylogeny［J］.Nucleic Acids Research，2010，38：D275-D279.

［26］粟曉黎，林瑞超，王兆基，等.中藥鬼臼毒性成分HPLC/UV指紋圖譜分析方法研究及與威靈仙、龍膽HPLC圖譜比較［J］.中成藥，2000，22（12）：819-824.

［27］劉虹，崔紅，郭俊華.香加皮及其易混淆品的區(qū)別鑒定［J］.中醫(yī)藥學報，2004，32（2）：14-15.

［28］謝享忠.五加皮與香加皮的鑒別［J］.江西煤炭科技，1998，（3）：40.

［29］張文清，陳秀榕.五加皮易混品香加皮鑒別［J］.海峽藥學，1995，7（1）：4-5.

［30］文軍，朱昱蘋.東南亞地區(qū)五加科植物進化關系的初步研究［J］.云南植物研究，2008，30（4）：391-399.

Molecular Identification of Acanthopanacis Cortex Original Plant and Its Adulterants Based on ITS2 DNA Barcode

ZENG Xu1，2，LIQiu-shi1，WANG Qian1，XIE Li-fang4，ZHANG Ya-lan5，LUO Kun1，LIU Zhi-hua1，3
（1.Institute of Medicinal Plants Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing100193China；2.China Pharmaceutical University，Nanjing210098China；3.Nanjing Forestry University，Nanjing210037China；4.Information Center，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing100032China；5.Development of Pharmaceutical Sciences，Beijing City University，Beijing100083China）

Objective：To discriminate Acanthopanacis cortex original plant and its adulterants，and assure the authenticity and clinical curative effect of thismedicalmaterial.Methods：Download the ITS2 barcode sequences ofAcanthopanax gracilistylusand its adulterants from GenBank database.Sequence assembly and consensus sequence generation were performed using the CodonCode Aligner.Sequence analyseswere carried outby MEGA4.Phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining and Kimura 2-parameter methods.The ITS2 secondary structure was predicted using the ITS2 database and website found by Schultz et al.Results：In the two cluster dendrograms，Acanthopanax gracilistylusand its adulterantswere observed in a significant difference.To compare the ITS2 secondary structure of the origin plants of Acanthopanacis Cortex and its adulterants，we noticed that there were obviously distinguishes from other species in the number，size，position of loop and the angle of helix exsertion.Conclusion：ITS2 can be used to correctly identifyAcanthopanax gracilistylusand its adulterants，and it has a broad application prospect in the identification of Traditional Chinese Medicine.

Acanthopanax gracilistylus；DNA barcoding；ITS2；Identification

2011-11-23）

國家自然科學基金（81102746，81100077），北京市自然科學基金（5113033），國家人事部留學回國人員科技活動擇優(yōu)資助項目，美國中華醫(yī)學會基金（A2009001），國家科技重大專項（2012ZX09301-002-001-025），協(xié)和青年基金，協(xié)和新星

* ［通訊作者］劉志華，Tel：（010）57833112，E-mail：zhliu＠implad.ac.cn