結(jié)直腸癌原發(fā)灶中CXCR6的表達(dá)與臨床意義*

陳志輝， 宋新明， 李欣欣， 何裕隆

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸胰外科，廣東 廣州 510080)

1000-4718(2012)05-0811-05

2012-02-21

2012-04-26

廣東省科技計劃項(xiàng)目(No.2011B031800118)

△通訊作者 Tel: 020-87755766; E-mail: bigo_sysu@163.com

結(jié)直腸癌原發(fā)灶中CXCR6的表達(dá)與臨床意義*

陳志輝， 宋新明△， 李欣欣， 何裕隆

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸胰外科，廣東 廣州 510080)

目的明確趨化因子受體CXCR6在結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的表達(dá)特點(diǎn)及臨床意義。方法收集2004年8月至2008年12月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的143例結(jié)直腸癌標(biāo)本及29例癌旁組織，應(yīng)用免疫組化方法檢測CXCR6的表達(dá)，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析圖片的平均累積吸光度(mIA)，分析CXCR6與同時性肝轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果CXCR6在結(jié)直腸癌組織中呈不同程度的陽性表達(dá)，在癌旁正常組織中弱表達(dá)或不表達(dá)。結(jié)直腸癌原發(fā)灶中CXCR6的mIA在0.41～2.84之間，平均為1.54±0.04，其中同時性肝轉(zhuǎn)移病例為1.63±0.05，無肝轉(zhuǎn)移病例為1.41±0.08，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以mIA值1.54為界，將病例劃分為CXCR6低表達(dá)組(mIA<1.54)和CXCR6高表達(dá)組(mIA≥1.54)。CXCR6高表達(dá)患者的總生存率顯著較低表達(dá)組差，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)年齡(P<0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)和同時性肝轉(zhuǎn)移(P<0.01)為結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，CXCR6為非獨(dú)立危險因素。CXCR6表達(dá)與IV期肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后無關(guān)(P>0.05)，與I～I(xiàn)II期結(jié)直腸癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論CXCR6與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生相關(guān)，它有望成為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移治療的一個重要靶點(diǎn)。

結(jié)直腸腫瘤； 趨化因子； CXCR6蛋白，人； 肝轉(zhuǎn)移； 預(yù)后

肝臟是結(jié)直腸癌最常見的轉(zhuǎn)移部位，據(jù)統(tǒng)計，確診時約15%～25%的結(jié)直腸癌患者出現(xiàn)同時性肝轉(zhuǎn)移，15%～20%接受根治性手術(shù)后發(fā)生異時性肝轉(zhuǎn)移[1]。

TNM分期及淋巴管浸潤是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移公認(rèn)的危險因素[2]，但其分子機(jī)制卻仍未明確。腫瘤轉(zhuǎn)移的其中一種機(jī)制是“種子-土壤”假說，即腫瘤擴(kuò)散必須同時具備擴(kuò)散的腫瘤細(xì)胞(種子)與適宜的轉(zhuǎn)移生長部位(土壤)，腫瘤細(xì)胞侵襲、突破周圍組織及基底膜，侵入血管并擴(kuò)散至循環(huán)系統(tǒng)，最后在合適的靶器官定植、生長[3]。然而腫瘤細(xì)胞并非在各個器官中均會形成轉(zhuǎn)移灶，每種腫瘤都有自己偏好的轉(zhuǎn)移器官，即所謂的器官特異性轉(zhuǎn)移。最近研究表明，趨化因子受體及其配體除了參與淋巴細(xì)胞歸巢、細(xì)胞遷移黏附及炎癥發(fā)生等一系列病理生理反應(yīng)外，還可能在腫瘤細(xì)胞增殖、血管新生及器官特異性轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用[4]。CXCL12/CXCR4是目前研究比較深入的一對趨化因子軸，靶器官大量分泌CXCL12，吸引循環(huán)中CXCR4陽性的腫瘤細(xì)胞在目標(biāo)器官定植、生長，從而參與各種腫瘤的器官特異性轉(zhuǎn)移[5-7]。然而針對CXCL12/CXCR4的治療并不能完全抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生[8]，因此其它趨化因子軸可能也共同參與其中。

CXCR6受體是趨化因子受體家族的另一個重要成員，它與唯一配體CXCL16的相互作用在前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用，阻斷CXCR6/Akt/mTOR通路可以明顯抑制前列腺癌的血管新生及侵襲[9]。目前CXCL16/CXCR6在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用仍不清楚。因此我們采用免疫組化方法檢測結(jié)直腸癌標(biāo)本中CXCR6的表達(dá)情況，以期闡明CXCR6在結(jié)直腸癌同時性肝轉(zhuǎn)移中的作用及其臨床意義。

材 料 和 方 法

1臨床資料

收集中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院2004年8月至2008年12月間外科手術(shù)切除的結(jié)直腸癌標(biāo)本143例，取其中29例癌旁正常組織(距離腫瘤>5 cm)作為對照。其中男性93例，女性50例，年齡在25～87歲之間，平均60.3歲。結(jié)腸癌76例，直腸癌67例。伴有同時性肝轉(zhuǎn)移83例，無同時性肝轉(zhuǎn)移60例。腫瘤分化程度分為分化型癌(高、中分化型腺癌)及分化不佳型癌(低分化腺癌、未分化腺癌、印戒細(xì)胞癌和黏液腺癌)，其中分化型癌121例，分化不佳型癌22例。所有患者均有完整的臨床病案資料及隨訪資料，結(jié)直腸癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)均經(jīng)病理切片檢查證實(shí)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移經(jīng)病理學(xué)或影像學(xué)檢查證實(shí)。隨訪采用電話與信件方式結(jié)合的方式進(jìn)行，隨訪終點(diǎn)為死亡或最終隨訪日(2011年12月)，隨訪時間為3～80個月，平均32個月。

2免疫組化檢測

取甲醛固定和石蠟包埋的腫瘤組織及癌旁正常組織切片至4 μm厚，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水后加入3%過氧化氫甲醇液中，室溫封閉10 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。切片在 0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)中95℃下煮沸15 min修復(fù)抗原。PBS 漂洗1次后，滴加5%正常山羊血清，室溫封閉30min以阻斷非特異性反應(yīng)，除去多余液體。加入兔抗人CXCR6多克隆抗體(1∶200稀釋，Abcam)4 ℃過夜；以PBS液代替Ⅰ抗作為陰性對照。PBS漂洗3次后，滴加多聚體抗兔IgG‐HRP，室溫孵育30 min。滴加試劑SABC。PBS漂洗3次后，DAB顯色，蒸餾水洗，蘇木素復(fù)染。乙醇和二甲苯脫水，中性樹脂常規(guī)封片。

3免疫組化結(jié)果判斷

采用Image-Pro Plus(IPP)6.0 軟件分析免疫組化圖片，先測量有效測量區(qū)域的面積，再測量該面積范圍內(nèi)目標(biāo)染色區(qū)域的累積吸光度值(integrated absorbance，IA)，兩者相除得到平均累積吸光度(mIA)，mIA與CXCR6表達(dá)呈正相關(guān)。

4統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件包(SPSS Inc)進(jìn)行統(tǒng)計分析。同時性肝轉(zhuǎn)移與無肝轉(zhuǎn)移組間mIA比較采用Student’st-test。采用Kaplan-Meier法計算總體生存率并描繪生存曲線。采用Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行預(yù)后的單因素及多因素回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1結(jié)直腸癌原發(fā)灶及癌旁組織CXCR6的表達(dá)

CXCR6在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中呈不同程度的陽性表達(dá)，見圖1A、B，部分腫瘤間質(zhì)浸潤的炎癥反應(yīng)細(xì)胞亦呈CXCR6弱陽性表達(dá)，見圖1A。CXCR6在結(jié)直腸癌組織中呈不同程度陽性表達(dá)，見圖2A、B、C，而在癌旁正常組織中呈少量弱表達(dá)或不表達(dá)，見圖2D。

2CXCR6表達(dá)與結(jié)直腸癌同時性肝轉(zhuǎn)移的關(guān)系

143例結(jié)直腸癌患者的基本資料見表1。結(jié)直腸癌原發(fā)灶中CXCR6mIA在0.41～2.84之間，平均為1.54±0.04，其中同時性肝轉(zhuǎn)移病例的mIA為1.63±0.05，無肝轉(zhuǎn)移病例為1.41±0.08，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.529，P<0.05)。mIA在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中無明顯差異(P>0.05)，在無脈管浸潤與有脈管浸潤病例中亦無明顯差異(P>0.05)。

Figure 1. Expression of CXCR6(×400).: cell membrane; ?: intercellular matrix.

圖1CXCR6在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及腫瘤間質(zhì)中表達(dá)

Figure 2. Positive staining of CXCR6 (A:strong;B:intermediate;C:weak) in colorectal cancer and negative staining (D) in adjacent normal colorectal tissues(×400).

圖2CXCR6在結(jié)直腸癌和癌旁正常組織中的表達(dá)

表1143例結(jié)直腸癌患者基本資料

Table 1. Baseline characteristics of the patients with colorectal cancer (n=143)

CharacteristicsDataAge[year.x±s(range)]60.3±1.1(25～87)Age≥60[n(%)]83(58.0)Male[n(%)]93(65.0)CXCR6mIA[x±s(range)]1.54±0.04(0.41～2.84)CXCR6mIA≥1.54[n(%)]66(46.7)Rectalcancer[n(%)]67(46.9)Tumorsize≥5cm[n(%)]95(66.4)Undifferentiatedtumor[n(%)]22(15.4)Lymphovascularinvasion[n(%)]38(26.6)T3～T4[n(%)]131(91.6)Lymphnodemetastasis[n(%)]105(73.4)Synchronouslivermetastasis[n(%)]83(58.0)

mIA：mean integrated absorbance

3CXCR6表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)CXCR6mIA的平均值1.54將病例劃分為CXCR6高表達(dá)組(mIA≥1.54)和CXCR6低表達(dá)組(mIA<1.54)，結(jié)果CXCR6低表達(dá)組1、3、5年總體生存率分別為81.8%、53.2%和32.3%，CXCR6高表達(dá)組1、3、5年總體生存率分別為81.8%、28.4%和11.2%，兩組總生存率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. Overall survival rate in high CXCR6 expression group was poorer than that in low CXCR6 expression group (P<0.05).

圖3CXCR6表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)

Cox單因素分析發(fā)現(xiàn)CXCR6、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、同時性肝轉(zhuǎn)移及脈管浸潤及年齡與結(jié)直腸癌患者總生存率相關(guān)，但多因素分析結(jié)果提示，只有年齡(P<0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)和同時性肝轉(zhuǎn)移(P<0.01)為結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，CXCR6為非獨(dú)立危險因素，見表2。

83例同時性肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者的中位生存時間為21個月，其中CXCR6高表達(dá)者為21個月，CXCR6低表達(dá)者為18個月，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4A。60例無同時性肝轉(zhuǎn)移的I～I(xiàn)II期結(jié)直腸癌患者中位生存時間為45個月，其中CXCR6高表達(dá)者為31個月，CXCR6低表達(dá)者為56個月，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4B。

討 論

CXCR6受體是跨膜G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員之一，其N 端區(qū)域與趨化因子配體結(jié)合, 胞內(nèi)區(qū)與G蛋白偶聯(lián),而C 端具有多個可磷酸化絲氨酸/蘇氨酸殘基, 主要參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。趨化因子配體與受體結(jié)合后在淋巴組織生成、淋巴細(xì)胞歸巢、細(xì)菌感染、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及皮膚病等一系列病理生理活動中起著非常重要的作用[10-12]，近年還發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

表2 143例結(jié)直腸癌患者預(yù)后單因素及多因素Cox回歸分析

OR: odd ratio； CI： confidence interval.

Figure 4. High CXCR6 expression was associtated with poorer overall survival in the patients with stage I～I(xiàn)II colorectal cancer (P<0.01, B) but not those with synchronuse liver metastasis (P>0.05, A)

圖4CXCR6表達(dá)與結(jié)直腸癌同時性肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的關(guān)系

本研究結(jié)果表明，CXCR6主要在癌組織中表達(dá)，而在癌旁正常組織弱表達(dá)或不表達(dá)，這表明CXCR6參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生。鑒于CXCR6在癌組織中廣泛表達(dá)，我們難以利用傳統(tǒng)的肉眼評判標(biāo)準(zhǔn)作出準(zhǔn)確的判斷，因此本研究采用了IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)測平均密度的方法進(jìn)行結(jié)果判斷。我們發(fā)現(xiàn)CXCR6表達(dá)與同時性肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生有關(guān)(P<0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管浸潤無關(guān)，該結(jié)果與既往的研究是一致的[13-14]。Cambien等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，阻斷CXCR3可顯著減少HT29細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生，卻不能抑制肝轉(zhuǎn)移。因此腫瘤轉(zhuǎn)移是非隨機(jī)的器官選擇性過程，不同類型的癌轉(zhuǎn)移目的地不同，不同的趨化因子信號通路在不同的器官特異性轉(zhuǎn)移中所起的作用。此外，現(xiàn)已明確CXCL16在肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞及竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞陽性表達(dá)[15-16]，這進(jìn)一步為CXCL16/CXCR6參與肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。

對于趨化因子是否系腫瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，目前各家報道差異較大[17-19]。我們研究發(fā)現(xiàn)，盡管CXCR6高表達(dá)組的總體生存率明顯比低表達(dá)組低，但經(jīng)過淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、同時性肝轉(zhuǎn)移、脈管浸潤及年齡等多因素校正后，我們發(fā)現(xiàn)CXCR6并不能作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。盡管CXCR6表達(dá)情況與IV期肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后無關(guān)，但其與I-III期結(jié)直腸癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，這與近年日本的一項(xiàng)研究的結(jié)果是一致的[20]。他們發(fā)現(xiàn)I～I(xiàn)II期結(jié)直腸癌患者血清中的CXCL16水平與異時性肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生呈正相關(guān)，術(shù)前血清CXCL16水平可用于預(yù)測結(jié)直腸癌患者肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生[20]。

綜上所述，CXCR6與結(jié)直腸癌同時性肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，結(jié)直腸癌組織中CXCR6的表達(dá)水平檢測對評估結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義。CXCL16/CXCR6參與肝轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制及其與異時性肝轉(zhuǎn)移的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。CXCR6可望成為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移治療的一個重要靶點(diǎn)。

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ExpressionandclinicalsignificanceofchemokinereceptorCXCR6inprimarycolorectalcancer

CHEN Zhi-hui, SONG Xin-ming, LI Xin-xin, HE Yu-long

(DepartmentofGastrointestinalandPancreaticSurgery,theFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:bigo_sysu@163.com)

AIM: To investigate the expression of chemokine receptor CXCR6 in primary colorectal cancer and determine the association between CXCR6 expression and synchronous liver metastasis/prognosis.METHODSThe colorectal cancer tissues from 143 patients were collected from August 2004 to December 2008 in the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University. Twenty-night cases of the adjacent normal colorectal tissues were enrolled as controls. The expression of CXCR6 was detected by immunohistochemistry and the mean intergrated absorbance (mIA) was calculated by Image-Pro Plus 6.0 software. The relationship between CXCR6 expression and synchronous liver metastasis/prognosis was analyzed.RESULTSThe CXCR6 staining was mainly positive in colorectal cancer tissues but not in adjacent normal colorectal tissues. ThemIAof CXCR6 in colorectal cancer was 1.54±0.04 (range: 0.41～2.84), and was 1.63±0.05 and 1.41±0.08 (P<0.05) in the cases with (n=83) or without (n=60) synchronous liver metastasis, respectively. According to the meanmIAof CXCR6 (1.54), the cases was divided into high CXCR6 group (mIA≥1.54) and low CXCR6 group (mIA<1.54). The overall survival rate in high CXCR6 group was significantly lower than that in low CXCR6 group (P<0.05). In multivariate Cox regression models, age (P<0.05), lymph node metastasis (P<0.05) and synchronous liver metastasis (P<0.01) but not CXCR6 were identified as independent risk factors for poor outcome. In subgroup analysis, high CXCR6 expression was associated with poorer survival in the patients with stage I～I(xiàn)II colorectal cancer (P<0.01) but not those with synchronous liver metastasis (P>0.05).CONCLUSIONCXCR6 in primary colorectal cancer tissues is associated with liver metastasis. It may become a potential target for the treatment of colorectal cancer liver metastasis.

Colorectal neoplasms; Chemokines; CXCR6 protein,human; Liver metastasis; Prognosis

R735.3+4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.008