高效液相色譜法測定穩(wěn)心顆粒中非法添加藥物的含量

張士勇，程 軍，葉 云

(安徽省蚌埠市第三人民醫(yī)院藥事辦，安徽 蚌埠 233000)

穩(wěn)心顆粒質(zhì)量標準收載于《國家藥品標準·新藥轉正標準(第 23 冊)》[WS3-205(X-029)-99(Z)]，是由黨參、三七、甘松等藥味經(jīng)加工制成的顆粒。由于原穩(wěn)心顆粒質(zhì)量標準中未列入非法添加抗心律失常類化學藥物的檢查和含量測定方法，且原穩(wěn)心顆粒補充檢驗方法建立時間較早(2003015)，僅檢測樣品中非法添加的鹽酸普羅帕酮。近年來，抗心律失常類化學藥物鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米、鹽酸普羅帕酮等[1-3]原料藥物購買容易，可能被不法分子添加到穩(wěn)心顆粒等同類中成藥中，對患者的用藥安全構成極大威脅。因此，有必要建立目前較普及的高效液相色譜法，檢測樣品中鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米、鹽酸普羅帕酮等化學藥物的含量。

1 儀器與試藥

Shimadzu LC-20A型全自動高效液相色譜儀;AE240型電子天平(瑞士Mettler)。鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號分別為 100783-200401，100223-200102);鹽酸普羅帕酮對照品(Sigma-Alorich，068K1558，5G，USA)，由上海安譜科學儀器有限公司提供。試驗中所用甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純;水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Inertsil ODS-SPC18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀6.8 g，辛烷磺酸鈉1.3 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-甲醇(40∶60);柱溫:25℃;流速:0.8 mL/min;檢測波長:223 nm;進樣量:10μL。

2.2 溶液制備

取鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米、鹽酸普羅帕酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米、鹽酸普羅帕酮各25μg的溶液，即得對照品溶液。取本品內(nèi)容物，研細，取約0.5 g，精密稱定，置三角燒瓶中，精密加入甲醇50.0 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率500 w，頻率40 kHz)20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，加甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取供試品溶液適量，加入一定體積的3種對照品貯備液，搖勻，即得含3種對照品的供試品溶液。

2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗:取鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米、鹽酸普羅帕酮混合對照品溶液，注入液相色譜儀中，結果3種對照品理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1.5，拖尾因子均介于0.95～1.05之間，重復性試驗 RSD均小于1.5%，符合藥典規(guī)定。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

標準曲線繪制:分別精密稱取鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮對照品24.70，25.00，24.87 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，定容。再分別精密吸取1.0 mL，置10 mL量瓶中，搖勻，制成每1 mL含鹽酸普萘洛爾0.247 mg、鹽酸維拉帕米0.25 mg和鹽酸普羅帕酮0.248 7 mg的溶液，作為對照品貯備液。分別精密吸取對照品貯備液，加甲醇制成系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。再分別吸取系列濃度的混合對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，依法測定，記錄色譜圖，計算峰面積積分值 A，以進樣量 C(μg)為橫坐標、峰面積積分 A均值為縱坐標，得回歸方程，鹽酸普萘洛爾 A=8×106C-27 393，r=1(n=8);鹽酸維拉帕米 A=2×106C-8 214.7，r=1(n=8)、鹽酸普羅帕酮 A=2×106C-5 820.1，r=1(n=8)。結果表明，鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮進樣量分別在0.019 76～2.47μg，0.01～2.5μg和0.009 948～2.487μg范圍內(nèi)與峰面積積分均值有良好線性關系。

精密度試驗:精密吸取1份混合對照品溶液10μL，重復進樣6次。結果鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮峰面積的 RSD分別為0.09%，0.20%和0.21%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0，1，2，3，18 h時在上述色譜條件下測定。結果鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮峰面積的 RSD分別為0.22%，0.28%和0.18%(n=5)，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

加樣回收試驗:取同一批號不含鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮的穩(wěn)心顆粒樣品6份，每份約0.5 g，精密稱定。分別精密加入每1 mL含鹽酸普萘洛爾2.717 mg、鹽酸維拉帕米2.75 mg和鹽酸普羅帕酮2.735 7 mg的混合對照品溶液1.0 mL，置三角燒瓶中，再精密加入甲醇24.0 mL，依法制成供試品溶液。精密吸取每1 mL含鹽酸普萘洛爾2.47 mg、鹽酸維拉帕米2.5 mg和鹽酸普羅帕酮2.487 mg的混合對照品溶液1.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為對照品溶液。分別吸取供試品溶液和對照品溶液各5μL，注入液相色譜儀，依法測定，計算回收率。結果鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮的平均回收率分別為97.11%，97.63%，98.88%，RSD分別為1.85%，1.92%，1.46%(n=6)。結果表明，方法的準確性較好。

2.4 樣品含量測定

按照上述擬訂的方法，對山東步長制藥有限公司生產(chǎn)的3批穩(wěn)心顆粒樣品(批號分別為090335，100803，100812)進行測定，結果未檢出鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮。

3 討論

在上述色譜條件下，分別精密吸取各對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，各色譜峰用PDA檢測器在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，結果鹽酸普萘洛爾的最大吸收波長為214.5，289.0 nm;鹽酸維拉帕米的最大吸收波長為230.1 nm;鹽酸普羅帕酮的最大吸收波長為247.9 nm、但鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米、鹽酸普羅帕酮在223 nm波長處均有較大吸收值，故選擇223 nm作為其液相色譜檢測波長。

鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮在甲醇中均易溶或溶解，均比在水中溶解度更好，故選擇甲醇作為供試品的提取溶劑。

試驗中參照文獻[4-10]，分別用流動相為不同比例的0.02 mol/L磷酸二氫鈉-甲醇、0.02 mol/L磷酸二氫鈉-甲醇-乙腈、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺、甲醇-0.1%冰醋酸進樣測定。試驗結果表明，選用不同比例的0.02 mol/L磷酸二氫鈉-甲醇、0.02 mol/L磷酸二氫鈉-甲醇-乙腈為流動相時，鹽酸普萘洛爾與鹽酸普羅帕酮、鹽酸維拉帕米分離度均較好，而鹽酸普羅帕酮與鹽酸維拉帕米保留時間相差小于1 min，分離度小于1.5，不符合《中國藥典》要求，故不選其為本法流動相;選用不同比例的甲醇-水-冰醋酸-三乙胺、甲醇-0.1%冰醋酸為流動相時，鹽酸維拉帕米均未出峰，故不選用其為本法流動相。選用磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀6.8 g，辛烷磺酸鈉1.3 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-甲醇(40∶60)作為流動相，鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮各峰峰形及分離度均較好，穩(wěn)心顆粒樣品在相應位置上均無干擾。

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