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    應(yīng)用MTT檢測(cè)乙酰唑胺對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用

    2012-11-05 09:23:30王艷麗張小猛
    關(guān)鍵詞:存活率卵巢癌顯著性

    王艷麗,張小猛

    (1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 婦 產(chǎn)科,吉林 長(zhǎng) 春130021;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 眼 科,吉林 長(zhǎng) 春130041)

    卵巢癌患者大多伴有大量腹水,目前其病理機(jī)制尚不完全清楚。水通道蛋白1(AQP1)是Agre最早發(fā)現(xiàn)的水通道,它分布廣泛,具有特異轉(zhuǎn)運(yùn)水的功能,與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),目前已成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)[1]。AQP-1與卵巢腫瘤的關(guān)系國(guó)內(nèi)外至今尚無(wú)報(bào)道。

    1 資料與方法

    1.1 試劑與方法

    IMDM培養(yǎng)液,Hanks液,PBS、青霉素鈉、硫酸鏈霉素、胎牛血清、均購(gòu)自Sigma公司;AQP1原位雜交試劑盒、凋亡原位末端標(biāo)記檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自博士德生物技術(shù)公司。MTT購(gòu)自鼎國(guó)生物試劑有限公司。人卵巢癌細(xì)胞株由大連醫(yī)科大學(xué)饋贈(zèng)。乙酰唑胺購(gòu)自Sigma公司方法:將卵巢癌細(xì)胞體外培養(yǎng),用96孔塑料板,每孔接種細(xì)胞懸液50μl;實(shí)驗(yàn)組加入乙酰唑胺50 μl使藥物終濃度分別為1×10-8mol/L、5×10-8mol/L、10×10-8mol/L(各三孔);對(duì)照孔不加藥(三孔);調(diào)零孔均加培養(yǎng)液(三孔)。以下按常規(guī)MTT法進(jìn)行。

    1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 MTT結(jié)果

    用MR700型酶標(biāo)定量?jī)x在試驗(yàn)波長(zhǎng)570 nm,參考波長(zhǎng)為450 nm下測(cè)定光密度值,按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%,結(jié)果見表1,圖1。

    表1 細(xì)胞存活率

    圖1 細(xì)胞存活率

    三條曲線分別代表不同培養(yǎng)濃度的實(shí)驗(yàn)組,隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng),各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率均下降,1×10-8mol/L時(shí)細(xì)胞存活率總體趨勢(shì)雖下降,但48 h時(shí)稍稍上升,考慮人為操作誤差。5×10-8mol/L和10×10-8mol/L細(xì)胞存活率明顯下降,10×10-8mol/L在48 h和72 h數(shù)值基本相同,考慮細(xì)胞存活率沒有明顯變化。

    3 討論

    1988年Agre等在鑒別人類Rh血型抗原時(shí)偶然在紅細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)了1種新的跨膜蛋白[1]。1991-1992年Agre等又完成了該蛋白的分子克隆和功能鑒定,證明該蛋白具有水通道功能,從而確認(rèn)了細(xì)胞膜上存在轉(zhuǎn)運(yùn)水的水通道蛋白的理論[2]。這種新的跨膜蛋白分子量為2.8×103,于1997年被正式命名為水通道蛋白1(AQP1).隨后,在許多動(dòng)、植物及微生物中相繼發(fā)現(xiàn)水通道蛋白。目前哺乳動(dòng)物的組織中已經(jīng)鑒定11種水通道白(AQP0-AQP10),廣泛分布于各種組織和器官,在維持機(jī)體的水平衡中起著重要的作用,且與水平衡紊亂所造成的一些疾病密切相關(guān),其中以AQP1分布最廣,作用最多。

    AQP1廣泛分布于機(jī)體,特別是那些與液體吸收和分泌有關(guān)的上皮細(xì)胞及可能協(xié)同水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的內(nèi)皮細(xì)胞中,AQP1只允許水自由雙向的穿過細(xì)胞膜,不轉(zhuǎn)運(yùn)離子,質(zhì)子等[3]。研究發(fā)現(xiàn):多種腫瘤組織亦表達(dá)AQP1,可能與腫瘤細(xì)胞的起源,生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[4,5]。此外,在微血管內(nèi)皮細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)AQP1的高度表達(dá),推測(cè)AQP1的高表達(dá)也可能與腫瘤的血管新生有關(guān)[6-8]。

    四唑鹽是一種能接受氫離子的染料,化學(xué)名是3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,商品名是噻唑藍(lán),簡(jiǎn)稱為MTT。MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率的機(jī)制是MTT在活細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶的作用下還原成難溶性藍(lán)色的甲潛(formazan),而死亡細(xì)胞卻不能,細(xì)胞存活越多,藍(lán)色產(chǎn)物在酶標(biāo)儀上檢測(cè)的OD值就越大。本研究應(yīng)用MTT法通過檢測(cè)細(xì)胞存活率來間接檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,可以從另一個(gè)角度來檢測(cè)乙酰唑胺對(duì)AQP1的抑制作用。結(jié)果顯示:1×10-8mol/L組分別和5×10-8mol/L組、10×10-5mol/L組相比,差異均有顯著性(P<0.05)。5×10-8mol/L組和10×10-5mol/L組之間差異沒有顯著性(P>0.05)。在24 h與72 h之間比較,差異有顯著性(P<0.05)。24 h與48 h之間,48 h與72 h之間差異沒有顯著性(P>0.05)。證明乙酰唑胺對(duì)體外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞AQP1的抑制作用與時(shí)間、濃度有一定的關(guān)系但是具體的相關(guān)性還需進(jìn)一步證明。實(shí)驗(yàn)組在藥物濃度為1×10-8mol/L時(shí),細(xì)胞存活率總體趨勢(shì)是下降,但是48 h時(shí)有一個(gè)上升,考慮實(shí)驗(yàn)中有很多因素包括人為因素引起的誤差,考慮該點(diǎn)的上升為實(shí)驗(yàn)的偶然性。實(shí)驗(yàn)組藥物濃度為10×10-8mol/L時(shí),隨著培養(yǎng)時(shí)間增加,24 h與48 h之間細(xì)胞存活率有明顯變化,但是48 h與72 h之間細(xì)胞存活率沒有明顯變化。實(shí)驗(yàn)組在藥物濃度為5×10-8mol/L時(shí),隨培養(yǎng)時(shí)間的增加,細(xì)胞存活率明顯下降,即細(xì)胞凋亡率明顯上升,所以原位末端標(biāo)記法和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法均采用該濃度為實(shí)驗(yàn)組。

    本實(shí)驗(yàn)證明了應(yīng)用乙酰唑胺可以抑制體外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞的培養(yǎng),推測(cè)應(yīng)用AQP抑制劑可以抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移,至少可能部分抑制腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移,希望通過開發(fā)應(yīng)用水通道蛋白抑制劑來治療腫瘤。

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