結(jié)核分枝桿菌抗原模擬肽納米金生物傳感器診斷結(jié)核病

孫文霞，袁仕善＊，黃昊文，譚云洪，黃紹文，張小萍

（1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410013；2.湖南科技大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭411201；3.湖南省結(jié)核病防治研究所，湖南 長(zhǎng)沙410013）

結(jié)核?。═uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的傳染病，目前在全球范圍內(nèi)疫情非常嚴(yán)重，早期診斷和治療是有效控制TB的重要途徑。免疫學(xué)診斷是目前診斷結(jié)核病的常用方法，免疫學(xué)診斷的抗原主要有菌體蛋白、菌糖脂抗原、菌抗原模擬肽等；檢測(cè)方法主要有酶免法。該方法簡(jiǎn)單快速，價(jià)格低廉，但需要酶標(biāo)二抗和底物。表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)是一種新型高靈敏度的生物傳感技術(shù)，可直接、實(shí)時(shí)、原位、在線(xiàn)監(jiān)測(cè)生物分子間的相互作用，無(wú)需任何標(biāo)記，樣品用量少，可連續(xù)監(jiān)測(cè)結(jié)合和解離過(guò)程，并可以進(jìn)行多組分復(fù)合物的相互作用研究［1，2］。納米金生物傳感器是一種基于納米金局域表面等離子體共振（Localized surface plasmon resonance，LSPR）的非標(biāo)記生物傳感器，這類(lèi)傳感器以納米金單層作為界面固定抗原／抗體，具有非特異性吸附小、傳感器能反復(fù)再生等優(yōu)點(diǎn)，非常適于抗原－抗體相互作用的研究［3，4］。本研究旨在納米金生物傳感技術(shù)的基礎(chǔ)上，以結(jié)核分枝桿菌模擬肽為抗原，建立納米金生物傳感器，為結(jié)核病的診斷提供新的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

硼氫化鈉（NaBH4）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、抗 壞 血 酸 硝 酸 銀 （AgNO3）、氯 金 酸（AuCl3）均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，十一巰基十一烷酸（MUA）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）購(gòu)于上海晶純?cè)噭┯邢薰?，均為分析純；結(jié)核分枝桿菌抗原模擬短肽T1由上海生工生物工程公司合成；結(jié)核患者血清由湖南省結(jié)核病防治研究所檢驗(yàn)科提供，均為抗酸桿菌痰涂片陽(yáng)性、血清抗結(jié)核抗體陽(yáng)性的患者；正常人血清由湖南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科提供，為健康體檢無(wú)異常者。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)核分枝桿菌抗原模擬肽的合成 以純化的結(jié)核患者血清IgG為靶分子，從噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)中免疫篩選出能與結(jié)核患者血清IgG特異性結(jié)合的噬菌體，噬菌體克隆DNA經(jīng)測(cè)序分析獲得結(jié)核桿菌抗原模擬肽核酸序列，推導(dǎo)出其氨基酸序列為ILAMRYDTTLKY。委托上海生工生物工程公司按此序列合成模擬短肽，記為T(mén)1。

1.2.2 納米金種子溶液的制備 在室溫（20－25℃）條件下，向10ml 0.1mol／L CTAB溶液中加入0.24ml 1%AuCl3溶液，攪拌并加入5ml雙蒸水，緩慢加入冷藏的0.01mol／L NaBH4溶液，觀察溶液顏色變化：黃色→無(wú)色→淺棕色，繼續(xù)攪拌2－4 min，即得納米金種子溶液。制好的種子溶液于25℃環(huán)境中靜置2h以上備用。

1.2.3 金納米棒的制備 在室溫（20－25℃）條件下，向30ml 0.1mol／L CTAB溶液中依次加入0.8 ml 0.01mol／L AgNO3溶液和1.5ml 1%AuCl3溶液，經(jīng)攪拌溶液迅速變?yōu)榧t棕色。逐滴加入0.1 mol／L抗壞血酸溶液直至溶液剛好褪色，繼續(xù)攪拌4－5min即得納米棒的成長(zhǎng)液。向成長(zhǎng)液中加入70μl納米金種子溶液，繼續(xù)攪拌2min，將溶液靜置于25℃環(huán)境中，觀察顏色變化。待顏色不再變化穩(wěn)定后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描。掃描波長(zhǎng)為1 100－400nm，雙蒸水調(diào)基線(xiàn)，觀察金納米棒的特征吸收峰：縱向等離子體吸收峰（longitudinal plasmon peak，LPP，一般由納米棒粒子的縱橫比決定）和橫向等離子體吸收峰（transverse plasmon peak，TPP）的位置，記錄為L(zhǎng)PW和TPW。

1.2.4 金納米棒的活化 在室溫（20－25℃）條件下，取6ml金納米棒溶液，加入1.2ml 0.005mol／L MUA溶液，混勻密封，于27－30℃環(huán)境下靜置12h。14 000r／min離心10min，除去上層清液，用0.01mol／L CTAB溶液分散，搖勻。分散的金納米棒溶液中加入EDC至終濃度為75mmol／L，充分混勻。加入NHS至終濃度為15mmol／L，充分混勻。室溫下活化40min。8 000r／min離心10min，除去上層清液，用雙蒸水分散，搖勻。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，觀察金納米棒溶液的LPW和TPW，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5 金納米棒與抗原的作用 在室溫（20－25℃）條件下，每6ml活化后的金納米棒溶液加入50 μl 0.4mg／ml的合成短肽T1。將接入抗原的金納米棒溶液于25℃的恒溫箱中靜置1h，讓其充分反應(yīng)。1h后將該溶液用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，觀察溶液的LPW和TPW，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6 血清學(xué)分析 接上合成短肽T1的金納米棒溶液即為構(gòu)建好的納米金生物傳感器，室溫（20－25℃）條件下，將納米金生物傳感器按2ml每份分裝。將結(jié)核病人血清樣品和正常人血清樣品用雙蒸水稀釋100倍。往分裝的2ml納米金生物傳感器中加入20μl稀釋后的血清，此時(shí)血清最終反應(yīng)濃度為104倍稀釋?zhuān)o置于恒溫箱中作用2min左右。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)反應(yīng)后的金納米棒溶液，觀察其LPW和TPW，記錄數(shù)據(jù)，以病人／正常人紅移值（P／N）≧2.0判定為陽(yáng)性，并計(jì)算敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、診斷效率。

1.2.7 儀器表征 可見(jiàn)近紅外光譜（Vis－NIR spectroscopy）在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上檢測(cè)，以雙蒸水為基準(zhǔn)，光譜掃描范圍為1100－400nm。

2 結(jié)果

2.1 金納米棒的制備

金納米棒溶液制好后，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，圖1為其 Vis－NIR吸收光譜圖，由Vis－NIR吸收光譜圖可知，約520nm處的吸收峰為金納米棒的橫向等離子體峰TPP，730nm附近的吸收峰是縱向等離子體峰LPP。

2.2 納米金傳感器的構(gòu)建

制備好的金納米棒與合成短肽結(jié)合，圖2為金納米棒修飾抗原前后的Vis－NIR吸收光譜圖。其LPW從760nm轉(zhuǎn)變?yōu)?68nm，LPP的波長(zhǎng)位置發(fā)生了8nm的紅移?？乖揎棾晒蠹礊榭捎玫募{米金生物傳感器。

2.3 納米金生物傳感器診斷結(jié)核病

將納米金生物傳感器分別與結(jié)核病人血清、正常人血清反應(yīng)，圖3為反應(yīng)前后Vis－NIR吸收光譜圖。a為完成表面修飾的金納米棒，其LPW為804 nm；b為與結(jié)核病人血清作用的金納米棒，其LPW為815nm；c為與正常人血清作用的金納米棒，其LPW為807nm?？芍猅1－Au NRs檢測(cè)結(jié)核病人血清時(shí)其LPW紅移了11nm，檢測(cè)正常血清時(shí)LPW只紅移3nm。這與抗原－抗體的特異性反應(yīng) 效果是一致的。

圖1 金納米棒的Vis－NIR吸收光譜圖

圖2 金納米棒表面抗原修飾前后的Vis－NIR吸收光譜圖

圖3 T1－Au NRs與血清反應(yīng)的Vis－NIR吸收光譜圖

用T1－Au NRs對(duì)56份結(jié)核病人血清和56份正常人血清進(jìn)行檢測(cè)，參與檢測(cè)的病人血清中，大部分反應(yīng)發(fā)生了5－20nm的紅移。按P／N≧2.0判定為陽(yáng)性，對(duì)病人血清的檢出率為57.1%，而對(duì)正常人血清亦有16.1%的陽(yáng)性率，經(jīng)檢驗(yàn)，陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。計(jì)算得敏感性為57.1%，特異性為83.9%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為78.0%，陰性預(yù)測(cè)值為66.2%，診斷效率為70.5%。結(jié)果見(jiàn)圖4和表1。

圖4 T1－Au NRs的血清學(xué)分析

表1 T1－Au NRs診斷結(jié)核病

3 討論

金納米棒是一種金圓柱體的棒狀物，因其直徑大約為10－20nm，長(zhǎng)度約為40－200nm而得名。金納米棒的合成方法很多，如模板法［5，6］、電化學(xué)法［7］和種子生長(zhǎng)法［8－12］等。Nikoobakht等改進(jìn)了種子生長(zhǎng)法，使金納米棒的產(chǎn)率高達(dá)99%［10］。后來(lái)，Murphy等報(bào)道了一種合成不同形狀和尺寸的金納米顆粒的方法［11］。本研究在Nikoobakht種子生長(zhǎng)法的基礎(chǔ)上對(duì)部分實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了修改，制備合成了分散性好、產(chǎn)率高的金納米棒。

LSPR是一種由入射光（電磁場(chǎng)）與金屬納米粒子表面自由電子間相互作用產(chǎn)生的物理光學(xué)現(xiàn)象，入射光激發(fā)金屬粒子表面自由電子發(fā)生集體振蕩，當(dāng)入射光頻率與自由電子集體振蕩頻率相等時(shí)達(dá)到共振，并在紫外－可見(jiàn)吸收光譜中表現(xiàn)出特征吸收峰［13］。這種共振頻率與電子密度、粒子大小和形狀等密切相關(guān)。對(duì)于金納米棒，因?yàn)殡娮釉陂L(zhǎng)軸和短軸方向的振蕩頻率顯然有所差異，從而表現(xiàn)出兩種不同共振頻率，即縱向和橫向表面等離子共振，在Vis－NIR圖譜上則表現(xiàn)為沿縱向長(zhǎng)度方向激發(fā)所引起的縱向等離子體峰（LPP）和沿橫向?qū)挾确较蚣ぐl(fā)所引起的橫向等離子體峰（TPP）。已證明Vis－NIR吸收光譜圖的改變很大程度上取決于納米粒子的形狀和其所處的環(huán)境［14－17］。對(duì)金納米棒進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)，經(jīng)其吸光光譜圖發(fā)現(xiàn)，TPP的波長(zhǎng)（TPW）隨橫向?qū)挾鹊淖兓惶黠@，而LPP的波長(zhǎng)（LPW）會(huì)隨著納米棒縱橫比的變化而呈較明顯的變化，即不同縱橫比的納米棒對(duì)應(yīng)著不同的縱向等離子體。因此，當(dāng)金納米棒上結(jié)合了活化劑等分子時(shí)，納米棒的縱橫比會(huì)發(fā)生改變，從而引起LPW發(fā)生改變，由此可以根據(jù)LPW的改變來(lái)觀察金納米棒的修飾及抗原抗體的結(jié)合作用。

Kah等［18］證明基于金納米棒的SPR技術(shù)可以對(duì)普通癌癥進(jìn)行早期診斷。Sironi等［19］將抗－p53抗體結(jié)合到金納米棒，并與異硫氰酸熒光素（Fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）結(jié)合構(gòu)建SPR傳感器，對(duì)p53的檢測(cè)濃度為200－400pmol／L。Lee等［20］將抗β3－淀粉樣蛋白（1－40）抗體包被到金納米粒子形成免疫復(fù)合物，建立的SPR傳感器成功用于β3－淀粉樣蛋白（1－40）的檢測(cè)，有利于阿爾茨海默氏癥的早期發(fā)現(xiàn)。雖然該技術(shù)已經(jīng)在多種疾病的診斷方面獲得應(yīng)用，但目前其在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用還比較罕見(jiàn)。診斷試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括靈敏度、特異性、預(yù)測(cè)值及診斷效率，理想的試驗(yàn)應(yīng)能使任何一個(gè)病人都表現(xiàn)出陽(yáng)性結(jié)果，任何一個(gè)健康者都表現(xiàn)為陰性結(jié)果，但實(shí)際上這種理想試驗(yàn)結(jié)果是不存在的。本文利用合成肽T1構(gòu)建納米金生物傳感器，對(duì)112例血清樣品分別進(jìn)行了血清學(xué)檢測(cè)分析，并計(jì)算了各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果顯示，T1－Au NRs對(duì)結(jié)核病人血清的診斷陽(yáng)性率為57.1%，特異性為83.9%，對(duì)結(jié)核病有著較好的診斷價(jià)值。T1－Au NRs對(duì)正常人血清也有一定的陽(yáng)性反應(yīng)，但經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析比較陽(yáng)性率，發(fā)現(xiàn)差異是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。納米金生物傳感器用做診斷有著簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)一個(gè)血清樣品僅需2min，且多個(gè)樣品可同時(shí)檢測(cè)，最大的優(yōu)點(diǎn)便在于不需要標(biāo)記抗體，省去了繁瑣的洗滌步驟。

總之，本實(shí)驗(yàn)對(duì)一種基于LSPR的、快速簡(jiǎn)單且價(jià)廉的診斷結(jié)核病的新方法進(jìn)行了探索研究。經(jīng)過(guò)MUA、EDC和NHS的化學(xué)修飾，我們將合成肽結(jié)合到了Au NRs上，成功獲得了T1－Au NRs，血清學(xué)分析證明T1－Au NRs對(duì)結(jié)核病有較理想的診斷價(jià)值，相信這種傳感器將會(huì)成為結(jié)核病診斷的有用技術(shù)。

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