玉竹糖蛋白的分離純化及理化性質(zhì)的研究

鄒柯婷，李 淼，陳 雙，段玉峰，*，杜曉旭，楊 聞

(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062; 2.深圳波頓香料有限公司，廣東深圳518000)

玉竹糖蛋白的分離純化及理化性質(zhì)的研究

鄒柯婷1，李 淼2，陳 雙1，段玉峰1，*，杜曉旭1，楊 聞1

(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062; 2.深圳波頓香料有限公司，廣東深圳518000)

采用DEAE－52離子交換和Sephadex G－100柱層析法分離純化玉竹糖蛋白粗品，得到了兩種糖蛋白組分PDGP'－1和PDGP'－2，并對(duì)兩種組分的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，兩種組分均為酸性糖蛋白，糖含量分別為75.22%和75.13%，蛋白質(zhì)含量分別為16.35%和18.42%。紅外光譜分析表明PDGP'－1中含鼠李糖、半乳糖和葡萄糖，PDGP'－2中含半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和果糖。兩種糖蛋白分子都含有吡喃糖環(huán)。

玉竹，糖蛋白，純化，理化性質(zhì)

玉竹(polygonatumodoratum(Mill.)Druee)屬百合科黃精屬植物玉竹類(lèi)，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源類(lèi)植物［1］，富含多糖、黃酮、生物堿和鉀、鈣、鈉、鐵、錳等礦物質(zhì)元素［2－3］，可用于保健和食療，具有降血脂、降血壓、緩解動(dòng)脈粥樣硬化之功效［4－6］。目前，對(duì)玉竹的研究主要集中在其營(yíng)養(yǎng)成分方面，對(duì)玉竹中糖蛋白等功能成分的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此開(kāi)發(fā)和利用玉竹有著極大的潛力和廣闊前景［3］。本研究以成都中醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院出售的中藥節(jié)狀四川玉竹為原料，研究了玉竹糖蛋白的分離純化及理化性質(zhì)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用玉竹提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

玉竹 成都中醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院，產(chǎn)地四川; DEAE－52纖維素 Whatman公司;Sephadex G－100 Pharmacia公司;N，N'－亞甲基雙丙烯酰胺Genview公司;其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Beckman121MB型氨基酸自動(dòng)分析儀 美國(guó)Beckman公司;LXJ－ⅡB型低速大容量多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠;Trace 2000型氣相色譜儀 德國(guó)菲尼克斯公司;GM型真空冷凍干燥器 德國(guó)Christ公司;TU－1800紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;WZZ－ⅡB型自動(dòng)旋光儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DBS－100型全自動(dòng)電腦收集器、DHL－A型電腦恒流泵 上海西儀分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉竹糖蛋白的提取及純化

1.2.1.1 提取工藝流程 玉竹糖蛋白的提取采用微波輔助提取工藝［7］，提取出的玉竹糖蛋白經(jīng)Savage法脫游離蛋白(氯仿∶正丁醇=4∶1，糖蛋白液∶Savage試劑=1∶5)、透析(自來(lái)水3d，蒸餾水1d)、沉淀、真空冷凍干燥后得玉竹糖蛋白粗品。

1.2.1.2 分離純化 將處理好且懸浮于蒸餾水中的DEAE－52緩緩倒入柱中。柱外振動(dòng)，以保證整個(gè)柱床內(nèi)無(wú)氣泡。蒸餾水預(yù)洗脫至流出液pH為7。

取0.3g玉竹糖蛋白粗品用5mL左右的蒸餾水在超聲條件下溶解，然后將該溶液沿著柱壁緩慢加入DEAE－52層析柱。待大部分樣品溶液被纖維素柱吸附后，用洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫劑依次為蒸餾水、0.1、0.2、0.3mol/L的NaCl溶液;流速:1.5mL/min;自動(dòng)收集器以每10mL為一管依次進(jìn)行收集。逐管檢測(cè)收集液在280nm和490nm處的吸光度，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)和多糖含量為縱坐標(biāo)，做洗脫曲線。合并收集同一峰位的洗脫液，濃縮、透析、干燥后得玉竹糖蛋白PFGP［8］。

將PDGP上Sephadex G－100凝膠柱(2.0m× 100cm)，用0.1mol/L NaCl溶液洗脫，方法同前，得玉竹糖蛋白組分PDGP'［9］。

1.2.2 玉竹糖蛋白的組成分析

1.2.2.1 氨基酸組成分析 取PDGP'20mg用18mL 6mol/L HCl溶液在110℃下真空充氮封管水解24h，取出冷卻后移至50mL容量瓶中定容、搖勻。過(guò)濾后取濾液1mL于25mL燒杯中，40℃下蒸干，再加入3mL 0.02mol/L HCl，靜置30min后攪拌均勻，用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析［10］。

1.2.2.2 單糖組成分析 取15mg PDGP'置于安瓿中，加入8mL 2mol/L CF3COOH使其充分溶解后封管，于120℃條件下水解10h;分別向10mg標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物、PDGP'水解物(P2O5干燥器中干燥24h)中加入0.2mL吡啶、0.2mL六甲基二硅胺烷和0.lmL三甲基氯硅烷(比例2∶1)，靜置10min后高速離心，取上清液。分別對(duì)玉竹糖蛋白水解液和混合標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品進(jìn)行氣相色譜分析［11］。

1.2.2.3 PDGP'紅外光譜分析 取1mg PDGP'和100mg溴化鉀置于瑪瑙研缽內(nèi)，混合均勻后研細(xì)，取少量粉末制成標(biāo)準(zhǔn)壓片，在500～4000nm條件下進(jìn)行掃描分析［12］。

1.2.3 玉竹糖蛋白理化性質(zhì)的測(cè)定

1.2.3.1 糖含量的測(cè)定 苯酚－硫酸法測(cè)定［13］，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 Folin－酚法測(cè)定［8］，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3.3 定性實(shí)驗(yàn)［14］280nm 處進(jìn)行紫外掃描、碘－碘化鉀反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)、CTAB反應(yīng)等。

1.2.3.4 (20±0.1)℃條件下，測(cè)定旋光度 參見(jiàn)文獻(xiàn)［15］。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉竹糖蛋白的純化

2.1.1 DEAE－52纖維素柱層析 合并洗脫曲線如圖1所示。

由圖1可知，經(jīng)過(guò)DEAE－52柱洗脫后，玉竹糖蛋白得到了較好的分離，共計(jì)得到兩種糖蛋白組分: PDGP－1(10～30管，蒸餾水洗脫)，PDGP－2(50～70管，0.1mol/L NaCl洗脫)。收集這兩個(gè)峰所對(duì)應(yīng)管中的洗脫液，透析、凍干。

2.1.2 SephadexG－100凝膠柱層析 分別將PDGP－1和PDGP－2兩種組分上Sephadex G－100凝膠柱，用0.1mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，以每10mL為一管依次進(jìn)行收集，流速控制為1.5mL/min。分離效果見(jiàn)圖2。

圖1 DEAE－52分離PDGP的柱層析圖譜Fig.1 Elusion chromatogram of PDGP on DEAE－52

圖2 PDGP－1和PDGP－2的SephadexG－100柱層析圖譜Fig.2 Elusion chromatogram of PDGP－1＆PDGP－2 on Sephadex G－100

PDGP－1和PDGP－2在Sephadex G－100柱層析過(guò)程中呈現(xiàn)單一且較對(duì)稱(chēng)吸收峰，且流出曲線中糖峰和蛋白峰出峰時(shí)間一致，說(shuō)明它們?cè)贒EAE－52柱層析中得到了有效分離。收集各吸收峰主峰部位對(duì)應(yīng)管中的洗脫液，真空冷凍干燥后得玉竹糖蛋白PDGP'－1、PDGP'－2，進(jìn)行組成分析和理化性質(zhì)研究。

2.2 玉竹糖蛋白的組成分析

2.2.1 氨基酸組成分析 氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定玉竹糖蛋白PDGP'－1、PDGP'－2的氨基酸組成，結(jié)果如表1所示。

表1 玉竹糖蛋白均一組分氨基酸組成及含量(g/100g)Table 1 The amino acid composition and content of each glycoprotein(g/100g)

由表1可知，PDGP'－1、PDGP'－2都含有18種能夠測(cè)出的氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸含量較高。

2.2.2 單糖組成分析 混合單糖氣相色譜分析如圖3所示。

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖氣相色譜圖Fig.3 GC of mixed standard monosacharides

氣相色譜中單糖與主要色譜峰的對(duì)應(yīng)關(guān)系如下:4.187為阿拉伯糖，4.305為鼠李糖，4.55、4.718為核糖，5.182為木糖，6.282為甘露糖，6.403為果糖，6.812為半乳糖，6.855為山梨糖，7.115為葡萄糖。

玉竹糖蛋白PDGP'－1、PDGP'－2的氣相分析結(jié)果如圖4、圖5所示。

圖4 PDGP'－1水解物氣相色譜圖Fig.4 GC of Hydrolysates of PDGP'－1

圖5 PDGP'－2水解物氣相色譜圖Fig.5 GC of Hydrolysates of PDGP'－2

分別將玉竹糖蛋白PDGP'－1、PDGP'－2的水解物氣相色譜圖與混合標(biāo)準(zhǔn)單糖氣相色譜圖對(duì)比，可看出PDGP'－1中的多糖主要由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖組成，PDGP'－2主要由半乳糖、葡萄糖組成，含少量的阿拉伯糖和果糖。

2.2.3 紅外分析 玉竹糖蛋白PDGP'－1、PDGP'－2的紅外光譜分析結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7。

圖6、圖7可知，兩種樣品在3400、2900、1640、1400cm－1附近都有吸收峰，這是多糖和蛋白分子的特征吸收峰。1400cm－1附近的吸收峰是C－H變角振動(dòng)吸收;3400cm－1附近的吸收峰說(shuō)明分子內(nèi)可能存在O－H;2900cm－1附近較弱的吸收峰是由C－H伸縮振動(dòng)所引起;1000～1075cm－1的吸收峰提示PDGP'－1、PDGP'－2的分子都含有吡喃型糖環(huán)［16］。

圖6 PDGP'－1的紅外光譜圖Fig.6 The infrared spectrum of PDGP'－1

圖7 PDGP'－2的紅外光譜圖Fig.7 The infrared spectrum of PDGP－2'

2.3 理化性質(zhì)

定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 PDGP'－1和PDGP'－2的理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical characteristics of PDGP'－1 and PDGP'－2

由表2可知，PDGP'－1的糖含量為75.22%，蛋白質(zhì)含量16.35%;PDGP'－2的糖含量為75.13%，蛋白質(zhì)含量18.42%;兩種組分均易溶于水，難溶于甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑。與碘－碘化鉀反應(yīng)不顯藍(lán)色，說(shuō)明兩種組分均是非淀粉類(lèi)多糖;雙縮脲反應(yīng)呈陽(yáng)性，說(shuō)明PDGP'－1、PDGP'－2糖鏈結(jié)構(gòu)中含有蛋白質(zhì);CTAB絡(luò)合反應(yīng)呈陽(yáng)性，說(shuō)明其為酸性物質(zhì)，初步判定玉竹糖蛋白為酸性糖蛋白。紫外掃描280nm處出現(xiàn)顯著吸收;兩種組分均為右旋物質(zhì)。

3 結(jié)論

對(duì)玉竹糖蛋白粗品用 DEAE－52纖維素及Sephadex G－100柱層析純化，得兩種糖蛋白組分PDGP'－1、PDGP'－2。兩種玉竹糖蛋白均含有能夠測(cè)定的氨基酸，并具有相同的氨基酸種類(lèi)。經(jīng)氣相色譜及紅外光譜分析測(cè)定，PDGP'－1、PDGP'－2都含有吡喃型糖環(huán)，PDGP'－1中的糖鏈主要由葡萄糖、半乳糖和鼠李糖組成，PDGP'－2中的糖鏈主要由葡萄糖、半乳糖組成，含少量的果糖和阿拉伯糖。

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Study on isolation，purification and physicochemical properties of glycoprtein from Polygonatum odoratum

ZOU Ke－ting1，LI Miao2，CHEN Shuang1，DUAN Yu－feng1，*，DU Xiao－xu1，YANG Wen1
(1.College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China; 2.Shenzhen Boton Flavours＆Fragrances Co.，Ltd.，Shenzhen 518000，China)

Two glycoproteins named PDGP'－1，PDGP'－2 were isolated and purified from the Polygonatum odoratum by the DEAE－52 and Sephadex G－100 column chromatography.Their physical and chemical properties were also studied.The results showed that both two glycoproteins were acidic glycoproteins.The sugar content of PDGP'－1，PDGP'－2 were:75.22%，75.13%，protein content were:16.35%，18.42%.IR analysis showed that PDGP'－1 contained rhamnose，galactose and glucose，PDGP'－2 contained galactose，glucose，arabinose and fructose.Both two glycoproteins contain pyran ring.

Polygonatum ordoratum;glycoprotein;purification;physicochemical properties

TS201.2+1

A

1002－0306(2012)08－0191－04

2011－07－19 *通訊聯(lián)系人

鄒柯婷(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品功能成分的開(kāi)發(fā)利用。

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2006B18)。