酪蛋白磷酸肽的質(zhì)量評價(jià)方法研究

陳雪香，羅 珍，劉 飛，黃曼曼，朱華偉，車 科，曹 庸，*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510640; 2.無限極(中國)有限公司，廣東廣州510665)

酪蛋白磷酸肽的質(zhì)量評價(jià)方法研究

陳雪香1，羅 珍2，劉 飛1，黃曼曼1，朱華偉1，車 科1，曹 庸1，*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510640; 2.無限極(中國)有限公司，廣東廣州510665)

對來自8種不同公司的酪蛋白磷酸肽(CPP)產(chǎn)品的含量、體外結(jié)合鈣離子的能力(即持鈣能力)用不同的測定方法進(jìn)行了測定和比較，采用氮磷比(N/P)、鋇乙醇沉淀法測定樣品含量，用pH滴定法和鈣離子選擇電極法測定了8種樣品的體外持鈣能力。研究結(jié)果表明:當(dāng)酪蛋白磷酸肽含量較低時(shí)選用N/P和鋇乙醇沉淀法測定結(jié)果偏差較大，應(yīng)選用高效液相色譜法(HPLC);pH滴定法和鈣離子選擇電極法兩種方法都能在一定程度上反映樣品體外持鈣能力的大小，但用pH滴定法測定的結(jié)果更符合產(chǎn)品含量的測定結(jié)果。本文為CPP開發(fā)過程中的質(zhì)量評價(jià)提供了一定的依據(jù)。

酪蛋白磷酸肽(CPP)，質(zhì)量評價(jià)體系，持鈣能力，含量

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CPP樣品 來自8個(gè)不同公司樣品。

G5砂心漏斗 廣州廣測儀器公司;DHG－9070鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;超純水發(fā)生器 美國millipore Milli－Q Synthesis;AL104萬分之一電子天平 梅特勒儀器有限公司;LC－10高效液相色譜儀配紫外檢測器 日本島津公司; Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜純 迪瑪公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總氮和總磷含量測定

1.2.1.1 氮含量的測定 凱氏定氮法:采用GB5009.5－2010進(jìn)行測定，消化樣品后，用自動(dòng)凱氏定氮儀蒸餾。為減小系統(tǒng)誤差，每一個(gè)樣品進(jìn)行蒸餾之前，先用堿水對系統(tǒng)進(jìn)行清洗，避免上一個(gè)樣中會(huì)有氮的殘留影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.1.2 磷含量測定 采用 GB5413.22－2010進(jìn)行測定。

1.2.2 乙醇鋇沉淀法［7］檢測CPP含量 稱取2.0000g樣品于燒杯中，加入20mL水，充分?jǐn)嚢枞芙狻Ｓ?mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.6，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管，于冷凍離心機(jī)5℃ 4000r/min離心30min。將上清液轉(zhuǎn)移至原燒杯中，用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8，轉(zhuǎn)移入50.0mL比色管中，用少量水洗滌燒杯，一起并入比色管中，控制總量少于23mL。加入4.5mL 10%氯化鋇溶液，再用水定容至25.0mL。加入無水乙醇，定容至50.0mL。于5℃冰箱放置12h以上。取出并將溶液倒入已干燥恒重的G5砂芯漏斗直接抽濾，用20mL 50%乙醇溶液分2～3遍洗滌比色管及沉淀物，繼續(xù)抽濾至濾液澄清。將裝有沉淀物的G5砂芯漏斗于105℃恒溫烘箱內(nèi)干燥至恒重。

1.2.3 高效液相色譜法［8］檢測CPP含量 稱取試樣0.0400～0.0600g，置于10mL容量瓶中，加水溶解(可加熱溶解)，定容至刻度線，然后過0.45μm濾膜，待用。

檢測器:SPD－10A紫外檢測器，CBM－10A控制器;色譜柱:檢測波長:215nm;流動(dòng)相A:水(0.1%TFA)，流動(dòng)相B:乙腈;梯度洗脫條件(B%):10%～70%(30min)，70%～80%(10min)，10%(10min);柱溫:常溫。

1.2.4 pH滴定法［9］測定CPP體外持鈣能力 準(zhǔn)確稱取樣品0.1000g(以干物質(zhì)計(jì))于500mL燒杯中，加100mL 0.016mol/L的NaH2PO4將CPP溶解，將反應(yīng)器置于25℃水浴中，加入濃度為0.016mol/L的CaCl2100mL，立即用0.1mol/L NaOH將反應(yīng)體系調(diào)至pH 7.20，并不斷滴加0.1mol/L NaOH，使反應(yīng)液pH保持在7.20。從調(diào)節(jié)pH開始計(jì)時(shí)，在2min內(nèi)將反應(yīng)體系調(diào)至 pH 7.20，從2min開始連續(xù)記錄 0.1mol/L NaOH的消耗量。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，0.1mol/L NaOH的消耗量為縱坐標(biāo)，得到持鈣能力曲線。鈣離子濃度是一定的，所以消耗的NaOH也是一定的，NaOH消耗時(shí)間的越長，說明其持鈣能力越好，反之則相反。

1.2.5 離子選擇性電極測定［10］測定CPP鈣結(jié)合能力

準(zhǔn)確稱取適量CPP(大概含純CPP 0.08g)樣品于500mL燒杯中，然后加入100mL 5mmol/L氯化鈣溶液、100mL 20mmol/L pH 8.0的磷酸二氫鉀溶液及7.46g氯化鉀，25℃下攪拌 30min，滴加 0.05mol/L NaOH將反應(yīng)體系的pH保持在7.80，將活化過的鈣離子選擇電極和參比電極放入到燒杯中，記錄好電動(dòng)勢的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 N/P法測定樣品CPP含量

根據(jù)1.2.1.1和1.2.1.2中測定不同樣品中N、P含量，并計(jì)算出N/P。從檢測結(jié)果比較，其N/P的大小依次為:CPP5＞CPP2＞CPP7＞CPP4＞CPP3＞CPP6＞CPP1＞CPP8。

圖1 不同樣品的N/PFig.1 N/P of different sample

2.2 HPLC法測定樣品CPP含量

用高效液相法檢測樣品中酪蛋白磷酸肽(CPP)含量，結(jié)果顯示樣品CPP6的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量最高，為24.07%。從檢測結(jié)果比較，其含量大小依次為:CPP6＞CPP3＞CPP2＞CPP4＞(CPP7，CPP5)＞CPP1＞CPP8。

圖2 HPLC法不同樣品中CPP含量比較Fig.2 Compare CPP content of various samples from HPLC analysis

2.3 乙醇－鋇法測定樣品CPP含量

乙醇－鋇沉淀法測定各樣品的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量，結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，樣品CPP6的 CPP含量最大為 38.01%。樣品 CPP4、CPP7、CPP8、CPP5和CPP3的酪蛋白磷酸肽(CPP)的含量均顯示在20%～25%的范圍內(nèi)，其大小排序?yàn)镃PP4＞CPP7＞CPP8＞CPP3。樣品CPP2、CPP1的酪蛋白磷酸肽(CPP)最小，分別為19.95%、19.43%。

圖3 乙醇－鋇沉淀法不同樣品中CPP含量比較Fig.3 Compare CPP content of various samples from ethanol－barium precipitation

2.4 pH滴定法測定酪蛋白磷酸肽(CPP)的體外持鈣能力

酪蛋白磷酸肽(CPP)持鈣能力曲線的測定結(jié)果如圖4所示，從結(jié)果可以看出，CPP6樣品的持鈣能力明顯優(yōu)于其他樣品，為38.7min，其余7個(gè)樣品的持鈣時(shí)間范圍為17.7～29min具有良好的持鈣活性，其活性強(qiáng)弱排序:CPP2＞CPP4＞CPP7＞CPP3＞CPP5＞CPP8＞CPP1。CPP2和CPP4號樣品持鈣時(shí)間要明顯高于其余5個(gè)樣品。

圖4 不同CPP樣品體外持鈣能力比較Fig.4 Compare ability to hold calcium in vitro of various CPP’s samples

2.5 離子選擇電極測定酪蛋白磷酸肽(CPP)鈣結(jié)合能力

由鈣離子選擇電極測定樣品持鈣能力結(jié)果可以看出:CPP2、CPP3、CPP4樣品的結(jié)合鈣能力明顯優(yōu)于其它樣品，其中CPP3樣品最強(qiáng)，2g/L的CPP樣品(絕對CPP濃度為0.4g/L)能溶解28.7mg/L，具有良好的結(jié)合鈣的能力。CPP6、CPP7、CPP8的鈣結(jié)合能力較弱，溶出的鈣離子濃度僅為 3～5.9mg/L，而CPP1、CPP5不能從磷酸鈣沉淀里溶解出游離鈣。

圖5 不同CPP樣品體外鈣結(jié)合能力Fig.5 Compare ability of Calcium－binding ability in vitro from various CPP’s samples

3 結(jié)論與討論

3.1 從8種不同樣品的N/P檢測結(jié)果可知，樣品的N/P的大小依次為 CPP5＞CPP2＞CPP7＞CPP4＞CPP3＞CPP6＞CPP1＞CPP8，馮鳳琴等用四種不同來源的高純樣品研究得出CPP的N/P摩爾比可反映CPP的純度和樣品持鈣能力的大小，N/P值越小，說明其CPP含量越高，磷酸根的密度越高，說明其持鈣能力越強(qiáng)。不同條件下制得的CPP其組成結(jié)構(gòu)、純度、磷酸基的密度均存在差異，因而其持鈣能力也不相同［11］。但本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述N/P和乙醇－鋇沉淀法的的結(jié)果相差較大，而其持鈣能力的大小與HPLC的分析結(jié)果較吻合。其原因可能是本文所選用的樣品純度較低，其中添加的其他成分對N/P結(jié)果影響較大，因此在測定酪蛋白磷酸肽樣品的純度時(shí)，如果樣品CPP含量較低選用N/P測定樣品的純度有一定的局限性。乙醇－鋇沉淀法其原理是沉淀可以和鋇鹽形成鉻合物的組分，樣品中添加的其他組分對結(jié)果也有一定的影響，故其結(jié)果與實(shí)際值偏差較大。HPLC方法針對樣品中活性中心對樣品純度進(jìn)行測定，目標(biāo)性較強(qiáng)，準(zhǔn)確，受影響因素較少。結(jié)合不同方法的測定原理，故8個(gè)不同樣品的CPP含量大小依次為:CPP6＞CPP3＞CPP2＞CPP4＞CPP7＞CPP5＞CPP1＞CPP8。在測定樣品CPP含量時(shí)，要考慮樣品的CPP含量范圍，高含量樣品選用N/P法、乙醇－鋇沉淀法或HPLC法其結(jié)果均是可信的，而當(dāng)樣品的CPP含量較低時(shí)選用目標(biāo)性較高、準(zhǔn)確性較好的HPLC法是最好選擇。

3.2 本論文選用pH滴定法和鈣離子選擇電極法測定樣品體外持鈣能力結(jié)果存在差異。pH滴定法保持溶液pH在7.2，通過加入氫氧化鈉的速度反映樣品阻止磷酸鈣沉淀的效果，根據(jù)測定NaOH消耗突然上升的時(shí)間來表征酪蛋白磷酸肽阻止磷酸鈣沉淀的效果［9］。鈣離子選擇電極法，測定在一定條件下被CPP保持在溶液中的鈣的數(shù)量。CPP對鈣吸收的促進(jìn)作用主要表現(xiàn)為CPP的核心部位在pH 7.8的條件下，能有效的與鈣形成可溶性復(fù)合物，抑制不溶性沉淀的生成，避免鈣的流失。最終可因游離鈣濃度的提高而促進(jìn)鈣的被動(dòng)吸收，鈣離子選擇電極通過測定用溶液中鈣離子濃度判定樣品結(jié)合鈣量，以鈣濃度大小判定樣品結(jié)合鈣能力的大?。?0］。從本文的結(jié)果可知:pH法更加適用于商品化的CPP持鈣活性檢測，因?yàn)樯唐坊腃PP通常已達(dá)鈣飽和，鈣飽和的CPP具有阻止磷酸鈣沉淀的能力，即具有持鈣活性;而鈣離子選擇電極法檢測結(jié)果不能較好地體現(xiàn)出CPP的持鈣活性，但脫鈣的CPP具有從磷酸鈣中結(jié)合鈣的能力;所以要全面地評價(jià)CPP產(chǎn)品的活性，還需要兩種方法結(jié)合起來。

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Study on the quality evaluation method on casein phosphopeptide(CPP)products

CHEN Xue－xiang1，LUO Zhen2，LIU Fei1，HUANG Man－man1，ZHU Hua－wei1，CHE Ke1，CAO Yong1，*
(1.College of Food Science，South China University of Agricultural，Guangzhou 510640，China; 2.Infinitus(China)Co.，Ltd.，Guangzhou 510665，China)

The quality determines the quality of casein phosphopeptide(CPP)products is very important for company.The article obtained a qulity evaluation system through compared different purity and calciumbinding capacities measures.The purity of 8 different samples examined and compared by N/P，Barium－ethanol precipitation and HPLC.The calcium binding capacities of casein phosphopeptide(CPP)were detected by pH titration technique and calcium ion－selective electrode.The result showed that purity examined by HPLC was more accurate when the sample’s purity was low and used the pH titration technique detected the calcium binding capacities was more chime in with the purity result.

casein phosphopeptide(CPP);quality evaluation system;the calcium binding capacities;content

TS201.2+1

A

1002－0306(2012)08－0075－04

酪蛋白磷酸肽(casein phosphor peptides，CPP)作為一種生物活性肽，是酪蛋白經(jīng)適合的蛋白酶消化所得到的一系列含有磷酸絲氨酸簇:—Serp—Serp—Serp—Glu—Glu的短肽。這些磷酸絲氨酸殘基在CPP的結(jié)構(gòu)、功能、性質(zhì)方面都起著至關(guān)重要的作用，比如結(jié)合鈣、保持其在體系中足夠大小的膠束等［1］。在堿性條件下，CPP可以防止鈣、鐵等離子的沉淀，從而促進(jìn)它們的吸收。CPP也因此被稱為鈣促進(jìn)因子［2－3］。研究表明，通過水解所獲得的生物活性肽，其分子量較小，在小腸內(nèi)可以以完整肽段的形式被人體吸收，安全性好，不會(huì)引起人體的免疫排斥反應(yīng)，加之其具有生理功能強(qiáng)、用量少的獨(dú)特優(yōu)勢，已越來越多地引起人們的重視，其工業(yè)化生產(chǎn)也成為當(dāng)前功能性食品和生物醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展的大趨勢［4］。國內(nèi)外相關(guān)研究文獻(xiàn)多，但只針對酪蛋白磷酸肽的一個(gè)或幾個(gè)指標(biāo)對其進(jìn)行評價(jià)，如黃祥元等［5］研究了CPP的N/P以期為生產(chǎn)高純度的酪蛋白磷酸肽提供依據(jù)，N/P越低，CPP阻止磷酸鈣沉淀效果越好。馮鳳琴［6］等用鈣離子選擇電極的方法來測定不同CPP的體外持鈣能力，但國內(nèi)外文獻(xiàn)并無建立CPP質(zhì)量評價(jià)體系的相關(guān)研究的報(bào)道，本文對不同來源的樣品采用N/P比方法、鋇－乙醇沉淀法和高效液相色譜法(HPLC)判斷樣品中酪蛋白磷酸肽的含量;用pH滴定法和Ca離子電極法從兩種不同角度測定樣品的持鈣能力，以期能夠得出一套準(zhǔn)確判斷CPP產(chǎn)品的質(zhì)量評價(jià)有效的方法，為工業(yè)化生產(chǎn)和檢測提供依據(jù)。

2011－03－07 *通訊聯(lián)系人

陳雪香(1981－)，女，碩士，助教，研究方向:功能食品及食品質(zhì)量安全。