一株低溫產(chǎn)甲烷菌的篩選分離與系統(tǒng)發(fā)育分析研究

張碩，葉爾買克，魯建江

（1石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院／新疆兵團(tuán)化工綠色過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003；2阿拉山口出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，阿拉山口833418）

產(chǎn)甲烷菌作為一類極端厭氧古菌，存在各類生境和極端環(huán)境中。最早研究起始于19世紀(jì)末，直到20世紀(jì)50年代Hungate厭氧技術(shù)［1］的出現(xiàn)，才使厭氧分離產(chǎn)甲烷菌得到發(fā)展，陸續(xù)分離出多種產(chǎn)甲烷菌。我國(guó)的研究起步較晚，20世紀(jì)90年代開(kāi)始陸續(xù)分離出多株產(chǎn)甲烷菌。隨著生物技術(shù)快速發(fā)展，那些能夠耐極端環(huán)境生存的產(chǎn)甲烷菌越來(lái)越受到重視，凍土、苔原、湖底污泥、火山溫泉等都曾有報(bào)道分離出各種嗜冷、嗜熱，耐鹽產(chǎn)甲烷古菌［2］。產(chǎn)甲烷菌作為自然界碳素循環(huán)中生物鏈的最后一環(huán)，只能利用低分子量的有機(jī)物，生成甲烷作為代謝的最終產(chǎn)物，溫室氣體排放到大氣中［3］。沼氣發(fā)酵產(chǎn)生的甲烷氣，同時(shí)也是一種清潔能源，對(duì)于有機(jī)廢水和固體垃圾處理的可再生利用具有重要意義。沼氣發(fā)酵是一個(gè)極其復(fù)雜微生物代謝過(guò)程；影響沼氣發(fā)酵最大因素是溫度的波動(dòng)和溫度的過(guò)低。通常冬季氣溫下降，會(huì)導(dǎo)致沼氣產(chǎn)量較低，限制了沼氣工程的推廣和發(fā)展。低溫厭氧發(fā)酵與中溫和高溫厭氧發(fā)酵過(guò)程相比，在能量盈余方面具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)［4］。然而，對(duì)于低溫厭氧發(fā)酵微生物菌群耐冷的生物學(xué)機(jī)制和生理學(xué)研究較少［5］。本文立足低溫厭氧發(fā)酵，從新疆越冬沼氣池篩選分離獲得一株產(chǎn)甲烷菌株SZ－3，兼性嗜冷，且低溫和中溫條件下都能夠產(chǎn)氣，對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)特性研究和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，并確立了菌株的遺傳學(xué)地位，這項(xiàng)工作為后續(xù)低溫耐冷厭氧發(fā)酵機(jī)理和菌群互營(yíng)共生關(guān)系研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)獲得優(yōu)良低溫產(chǎn)甲烷菌菌種資源，對(duì)于解決冬季沼氣池低溫發(fā)酵具有理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品來(lái)源

污泥樣品采自新疆越冬沼氣池，用滅菌后250 mL厭氧瓶取樣，厭氧瓶中充滿高純氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣。樣品取回后放4℃冰箱密閉儲(chǔ)存［6］。

1.1.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

產(chǎn)甲烷菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（1000mL）：K2HPO40.4g，KH2PO40.4g，NH4Cl 1.0g，MgCl20.1g，酵母浸粉1.0g，L－半胱氨酸0.5g，10mL微量元素溶液，10mL維生素溶液，0.1%刃天青2.0mL（固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂）。培養(yǎng)基加熱煮沸除去氧氣，121℃高壓滅菌15min；滅菌后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，分裝至20mL厭氧管和100mL血清瓶中。

（1）微量元素溶液（1000mL）：MgSO4·7H2O 3g；MnSO4·2H2O 0.5g；NaCl 1g；FeSO4·7H2O 0.1g；CoCl2·6H2O 0.1g；CaCl2·2H2O 0.1g；ZnSO4·7H2O 0.1g；CuSO40.01g；KAl（SO4）2·12H2O 0.01g；H3BO30.01g；Na2MoO4·2H2O 0.01g；NiCl2.6H2O 0.025g；NaSeO 3.6 H2O 0.0003g［7］。

（2）維生素溶液（1000mL）：硫胺素（B1）5.0g，泛酸鈣5.0g，核黃素（B2）5.0g，生物素2.0g，葉酸2.0g，B120.1g，煙酸5.0g，對(duì)氨基苯甲酸5.0g，硫辛酸5.0g。

（3）碳源物質(zhì)及還原劑：1%硫化鈉，5%碳酸氫鈉，2.5mol／L乙酸鈉，25%甲酸鈉，50%甲醇，30%甲胺，30%二甲胺，30%三甲胺。

產(chǎn)甲烷菌完全培養(yǎng)基（100mL）：80mL產(chǎn)甲烷菌無(wú)機(jī)鹽滅菌培養(yǎng)基，1%硫化鈉，5%碳酸氫鈉，2.5 mol／L乙酸鈉，25%甲酸鈉，50%甲醇，30%甲胺，30%二甲胺，30%三甲胺各2mL，頂部充滿 H2／CO2（80∶20）混合氣。

產(chǎn)甲烷菌純度鑒定培養(yǎng)基（100mL）：牛肉膏0.4g、胰蛋白胨1g、酵母膏1g、葡萄糖0.1g、纖維二糖0.1g、麥芽糖0.1g、可溶性淀粉0.1g、NaCl 0.05g、半胱氨酸0.05g、0.1%刃天青0.2mL、瓊脂2g。

1.2 方法

1.2.1產(chǎn)甲烷菌的富集培養(yǎng)及分離純化

采集的污泥樣品，加入到產(chǎn)甲烷菌完全培養(yǎng)基中（15℃低溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10d），第一次富集接種量10%，取菌液第二次富集，接種量2%，再進(jìn)行第三次富集，氣相色譜（Shimadzu GC 2010）測(cè)定產(chǎn)甲烷量達(dá)到最大，進(jìn)行滾管分離，挑取菌落繼續(xù)接種進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng)，再次滾管分離，直到鏡檢觀察菌體細(xì)胞形態(tài)一致且熒光顯微鏡下觀察到菌體熒光形態(tài)，最后得到純產(chǎn)甲烷菌株。產(chǎn)甲烷菌只能利乙酸、甲醇等簡(jiǎn)單小分子合成甲烷。將純化后菌株接種到產(chǎn)甲烷菌純度鑒定培養(yǎng)基中，15℃低溫厭氧培養(yǎng)10 d，觀察菌株是否生長(zhǎng)，生長(zhǎng)則表明該菌株不是產(chǎn)甲烷菌或含有互營(yíng)共生的雜菌，需再純化。

1.2.2低溫產(chǎn)甲烷菌株篩選

純化培養(yǎng)得到的產(chǎn)甲烷菌，能否適應(yīng)低溫條件需要進(jìn)行篩選；將產(chǎn)甲烷菌株接種到pH 7.0產(chǎn)甲烷完全液體培養(yǎng)基中，5℃、20℃、30℃恒溫厭氧培養(yǎng)10d，氣相色譜測(cè)定產(chǎn)氣情況，選擇能夠5℃低溫產(chǎn)氣良好，20℃、30℃產(chǎn)氣效果依舊良好的為目的菌株。

1.2.3菌體形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)

菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定：厭氧條件下每天抽氣和抽取培養(yǎng)液，測(cè)定菌株在最適培養(yǎng)條件下甲烷氣產(chǎn)量和菌體生長(zhǎng)量（OD值），以甲烷氣產(chǎn)量（Y1）、菌體生長(zhǎng)量（Y2）的對(duì)數(shù)值和時(shí)間繪制生長(zhǎng)曲線。菌體形態(tài)學(xué)觀察：采用日本尼康80i紫外熒光倒置顯微鏡，尼康倒置相差顯微鏡觀察。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期樣品8000r／min離心5min，少量磷酸緩沖液（PBS）懸浮，滴片至4～6mm玻片，自然干燥，即可進(jìn)行觀察。

最適溫度、pH、NaCl濃度生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)：在完全液體培養(yǎng)基中接種2%的菌株，厭氧培養(yǎng)箱（英國(guó)DWS公司）中恒溫培養(yǎng)10d，氣相色譜測(cè)定甲烷氣產(chǎn)量。

生長(zhǎng)底物：乙酸鈉，甲酸鈉，甲醇，甲胺，二甲胺，三甲胺，H2／CO2（80∶20）為單一的碳源，加入到滅菌后的產(chǎn)甲烷菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，pH7、20℃培養(yǎng)8 d測(cè)定是否產(chǎn)生甲烷氣，鑒定菌株能否利用這種碳源［8］。

抗生素實(shí)驗(yàn)：添加四環(huán)素、青霉素、氯霉素、卡那霉素、鏈霉素五種抗生素3200U／mL，20℃、10d觀察產(chǎn)甲烷菌的耐受性。

1.2.4 16SrDNA PCR擴(kuò)增

DNA參照《精編分子生物學(xué)指南》中細(xì)菌基因組制備方法，引物［9］由大連寶生物公司合成PRA46F （5－C／TTAAGCCATGCG／AAGT－3 ），PREA1100R （5－T／CGGGTCTCGCTCGTT G／ACC－3）；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5min，30個(gè)循環(huán)（95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min），最后72℃延伸10min。l%的瓊脂糖凝膠電泳，純化回收PCR產(chǎn)物，連接到pGM－T載體上，轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆，回收質(zhì)粒酶切驗(yàn)證；將PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒送交北京鼎國(guó)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5系統(tǒng)發(fā)育分析

目的菌株片段DNA序列經(jīng)測(cè)序后，提交到NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，將與之同源性較高的16SrDNA序列進(jìn)行ClustalX多重序列比對(duì)，使用MEGA 4.1軟件進(jìn)行bootstrap分析，重復(fù)1000次，p－distance核酸模型，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［10－11］。

2 結(jié)果分析

2.1 低溫產(chǎn)甲烷菌富集純化及篩選

厭氧富集，亨蓋特滾管分離和反復(fù)挑取菌落純化，相差顯微鏡和熒光顯微鏡下（產(chǎn)甲烷菌輔酶F420受激發(fā)后發(fā)出綠色熒光）觀察菌體細(xì)胞形態(tài)一致；后經(jīng)過(guò)純化鑒定獲得兩株純產(chǎn)甲烷菌菌株SZ－1、SZ－3。低溫篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果：SZ－1菌株不能適應(yīng)低溫生長(zhǎng)環(huán)境，5℃、15℃低溫條件下幾乎不產(chǎn)氣，30℃產(chǎn)氣活力良好；SZ－3菌株在5℃、15℃、20℃低溫條件下產(chǎn)氣效果良好，30℃中溫條件下仍能維持良好產(chǎn)甲烷氣效果；因此SZ－3菌株符合篩選要求。

2.2 菌株形態(tài)特征及生理生化特性

SZ－3菌株顯微鏡下觀察為革蘭氏染色陽(yáng)性，不運(yùn)動(dòng)，20℃培養(yǎng)10d長(zhǎng)出菌落，菌落呈黃色，圓形，邊緣整齊，紫外熒光倒置顯微鏡下觀察發(fā)綠色熒光（圖1a），相差顯微鏡下觀察（圖1b）為不規(guī)則球狀，菌體聚集形成假胞體，不規(guī)則裂殖。

圖1 菌株SZ－3紫外熒光顯微鏡和相差顯微鏡成像Fig.1 SZ－3UV fluorescence（a）and phase－contrast（b）micrograph

SZ－3菌株在pH值4～8均能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)最適pH值為7（圖2）。SZ－3菌株在5～40℃均能生長(zhǎng)，20℃條件下產(chǎn)氣量最大，菌株生長(zhǎng)良好（圖2）。SZ－3菌株在0～0.6mol／L NaCl濃度能夠生長(zhǎng)，高于0.6mol／L時(shí)產(chǎn)氣停止，NaCl濃度0～0.4mol／L時(shí)產(chǎn)氣量最大，菌株生長(zhǎng)良好（圖2）。

圖2 不同pH﹑溫度﹑NaCl濃度下的甲烷含量Fig.2 Methane production by strain SZ－3at different temperatures，pH values and NaCl concentrations

碳源底物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SZ－3菌株接種單一碳源的底物后，只能利用甲醇、H2／CO2（80∶20）混合氣、甲胺、二甲胺、三甲胺，不能利用甲酸鈉、乙酸鈉等，且該菌株對(duì)5種抗生素均有耐受性。

SZ－3菌株生長(zhǎng)曲線（圖3）顯示，第3天開(kāi)始，產(chǎn)氣量和活細(xì)胞數(shù)成對(duì)數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，第9天發(fā)酵液pH、底物濃度變化、產(chǎn)物積累抑制菌體生長(zhǎng)，進(jìn)入穩(wěn)定期，第11天開(kāi)始菌體開(kāi)始大量死亡，進(jìn)入衰亡期。

圖3 SZ－3菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of strain SZ－3

2.3 菌株序列測(cè)定結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

以SZ－3菌株的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳顯示大約1000bp左右，與設(shè)計(jì)引物1050bp大小相符，無(wú)非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)；測(cè)序結(jié)果提交NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，相似性最高的是Methanosarcina（產(chǎn)甲烷八疊球菌屬）的菌株，以此為根據(jù)選擇10株Methanosarcina屬菌株，Mthanothermobacter wolfeii strain DSM 2970菌株作為外群種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

菌株SZ－3與產(chǎn)甲烷八疊球菌屬的4個(gè)菌株的16SrDNA基因序列相似性為99%，根據(jù)同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）可以看出，菌株SZ－3與（M.lacustris）湖沉積甲烷八疊球菌種菌株在同一個(gè)分支里，與Methanosarcina lacustris DQ058823的親緣關(guān)系相近屬于同一種屬。

圖4 基于16SrDNA序列同源性構(gòu)建產(chǎn)甲烷八疊球菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Dendragram of Methanosarcina based on 16SrDNA sequence homology

SZ－3菌株生理生化特征比較（表1）；SZ－3菌株生長(zhǎng)最適溫度、pH、NaCl濃度、可利用碳源底物等都和湖沉積甲烷八疊球菌相近；系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果也表明SZ－3菌株與湖沉積甲烷八疊球菌親緣關(guān)系較近。

表1 SZ－3菌株與其他產(chǎn)甲烷八疊球菌屬菌株主要生理特征比較Tab.1 Comparison of strain SZ－3and other members of Methanosarcina

3 結(jié)論

使用厭氧分離技術(shù)從新疆低溫沼氣池中分離出兩株產(chǎn)甲烷菌菌株SZ－1和SZ－3，其中SZ－3能夠耐受低溫且符合兼性嗜冷篩選要求。SZ－3菌株熒光相差顯微鏡下觀察呈疊形球狀，菌株最適生長(zhǎng)溫度20℃，生長(zhǎng)最適pH值為7，最適NaCl濃度為0～0.4mol／L；該菌株革蘭氏染色陽(yáng)性，菌落呈黃色，菌株只能利用甲醇、H2／CO2（80∶20）混合氣、甲胺、二甲胺，三甲胺做為碳源底物進(jìn)行生長(zhǎng)；菌株對(duì)于四環(huán)素、青霉素、氯霉素、卡那霉素、鏈霉素5種抗生素均具有耐受性。SZ－3菌株系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示其與湖沉積甲烷八疊球菌親緣關(guān)系較近；結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征，最終確定菌株屬于湖沉積甲烷八疊球菌種。

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