一株產(chǎn)凝乳酶解淀粉芽孢桿菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)

張衛(wèi)兵，甘伯中，*，梁 琪，米 蘭，張 炎

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅蘭州730070；3.甘肅省干酪素工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730000）

一株產(chǎn)凝乳酶解淀粉芽孢桿菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)

張衛(wèi)兵1，2，3，甘伯中1，2，3，*，梁 琪1，2，3，米 蘭1，2，3，張 炎1，2，3

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅蘭州730070；3.甘肅省干酪素工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730000）

采用酪蛋白培養(yǎng)基，從甘南牦牛放牧區(qū)分離篩選產(chǎn)凝乳酶細菌。通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA序列同源分析對菌株進行鑒定，并對該菌株所產(chǎn)凝乳酶的特性進行了研究。從牧區(qū)采集的56個樣品中共篩選得到6株產(chǎn)凝乳酶細菌，復(fù)篩得到一株凝乳活力高、蛋白水解力低的菌株GN4.1，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），在麩皮培養(yǎng)基中發(fā)酵48h，凝乳活力可達1011.56SU/mL，蛋白水解力為14.61U/mL。凝乳酶的最適作用溫度為60℃，65℃加熱10min后凝乳活力喪失；最適作用pH為5.5，在pH3.5～8.5內(nèi)穩(wěn)定性較好。預(yù)期該菌株所產(chǎn)凝乳酶有用于乳品加工業(yè)的潛力。

解淀粉芽孢桿菌，凝乳酶，酶學(xué)性質(zhì)

凝乳酶（EC4.4.1.4）是酶法干酪和酶法干酪素生產(chǎn)中的關(guān)鍵性酶，又稱天冬氨酸蛋白酶，其主要的生物學(xué)功能是切斷κ-酪蛋白的Phe 105-Met 106肽鍵，導(dǎo)致牛奶凝結(jié)[1]。凝乳酶來源廣泛，主要有動物源凝乳酶、植物源凝乳酶以及微生物源凝乳酶。動物源凝乳酶是干酪生產(chǎn)過程中使用最多的凝乳酶，但隨著世界干酪產(chǎn)量逐年上升，每年屠宰大量的犢牛已經(jīng)無法滿足工業(yè)生產(chǎn)干酪的需求；植物源凝乳酶蛋白水解活力太強，且受時間、地點等因素限制[2-3]；由于微生物生長不受地域和氣候的影響，發(fā)酵容易控制，且來源廣泛，價格便宜，微生物源凝乳酶最有可能成為小牛凝乳酶替代品。國內(nèi)外已進行了大量關(guān)于凝乳酶的研究，到目前為止研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)凝乳酶的微生物主要包括鏈霉菌屬（Streptomyces）、小單胞菌屬（Micromonospora）、馬杜拉放線菌屬（Actinomadura）、根霉（Rhizopus）、微小毛霉（Mucor pusillus）、總狀毛霉（Mucor racemosu）、易脆毛霉（Mucorfuagilis）、米黑毛霉（Mucornichei）、寄生內(nèi)座殼菌（Endothiaparasitisa）、粟疫菌（Endothia parasitica）等，不同來源的凝乳酶酶學(xué)性質(zhì)差異很大[4-6]。利用高效優(yōu)良的產(chǎn)凝乳酶微生物，通過發(fā)酵法生產(chǎn)凝乳酶是目前最有前途的發(fā)展方向。國內(nèi)外關(guān)于產(chǎn)凝乳酶真菌和放線菌的報道很多，但關(guān)于產(chǎn)凝乳酶細菌的報道僅有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），由于凝乳活力不高而不能達到發(fā)酵生產(chǎn)的要求[7-10]。因此，篩選高效優(yōu)良的產(chǎn)凝乳酶細菌，發(fā)揮細菌體積小、繁殖快、產(chǎn)物易于提取分離的優(yōu)點，對微生物凝乳酶的研發(fā)和應(yīng)用十分必要。本研究擬從甘肅甘南牦牛牧區(qū)采集的土壤樣品中分離篩選產(chǎn)凝乳酶細菌，根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA同源性分析對菌株進行鑒定，并對其凝乳活力、蛋白水解活力和酶學(xué)性質(zhì)進行研究，以期為細菌凝乳酶開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樣品 甘肅甘南合作市、夏河縣、碌曲縣和瑪曲縣等地牧區(qū)牧場、牛舍、飲水區(qū)和擠奶區(qū)的土壤樣品56個，土壤采樣時用無菌刮鏟采集離地面10cm左右的土樣，放在玻璃瓶中于4℃保存?zhèn)溆?；培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨固體和液體培養(yǎng)基參照文獻[11]配制；酪蛋白液體培養(yǎng)基 蛋白胨0.25%，葡萄糖1%，酵母膏0.1%，干酪素1.0%，脫脂牛乳5%，pH7.0；酪蛋白固體培養(yǎng)基 酪蛋白液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂；麩皮培養(yǎng)基 將10g麩皮加入100mL自來水，煮沸10min，過濾后用自來水補足100mL，pH自然。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種初篩 稱1g樣品，進行梯度稀釋后吸取1mL涂布于酪蛋白培養(yǎng)基平板上，37℃下培養(yǎng)48h，選擇沉淀圈與水解圈比值大的單菌落，在牛肉膏蛋白胨平板進一步劃線分離，分純后編號接入斜面種子培養(yǎng)基，以備復(fù)篩和鑒定。

1.2.2 菌種復(fù)篩 將初篩所得菌種分別接種于麩皮培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基和酪蛋白液體培養(yǎng)基中，37℃，140r/min搖床培養(yǎng)48h后，取發(fā)酵液測定凝乳酶和蛋白水解活力。

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)特征 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板37℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)。將菌體進行芽孢染色，革蘭氏染色后于高倍顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。1.2.3.2 生理生化特征測定 參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]和《微生物學(xué)實驗》[13]測定菌株的生理生化特征。

1.2.3.3 16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 將菌體于10μL滅菌水中99℃變性10min，離心取上清液作為模板，采用通用引物。

上游：5’-ATGGATCCGAGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3’。

下游：5’-TATCTGCAGTGGTGTGACGGGCGGTG

其中：t為凝乳時間，D為稀釋倍數(shù)。

1.2.4.2 蛋白水解力測定 將發(fā)酵液于4000r/min，4℃下離心10min，取上清液測定其蛋白分解活力。取15×100mm試管3支，編號1、2、3，每管內(nèi)加入粗酶液1mL，置于40℃水浴中預(yù)熱2min，再各加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白1mL，精確保溫10min。時間到后，立即再各加入0.4mol/L三氯乙酸2mL，以終止反應(yīng)。繼續(xù)置于水浴中保溫20min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后過濾。然后另取15×150mm試管3支，編號1、2、3，每管內(nèi)加入濾液1mL，再加0.4mol/L碳酸鈉5mL，已稀釋的福林試劑1mL，搖勻后40℃保溫發(fā)色20min后進行光密度（OD660）測定。空白實驗也取試管3支，編號1、2、3，測定方法同上，在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。T-3’。

使用16S rDNA Bacterial Identification PCR儀，進行PCR擴增目的片段。反應(yīng)體系共50μL，94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，30個循環(huán)，72℃保溫5min。取5μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后切膠回收目的片斷進行DNA測序。測序由大連寶生物公司完成，將測定的16S rDNA序列在NCBI使用Blast與GenBank中核酸序列數(shù)據(jù)庫進行比對分析，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得與菌株16S rDNA同源的公認標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)，使用ClustalX 1.8對齊后利用軟件MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 酶活力的測定

1.2.4.1 凝乳酶活力測定 采用Arima方法[6]。將發(fā)酵液在4000r/min，4℃下離心10min，取上清液測定凝乳酶活力。取5mL 100g/L的脫脂乳，在35℃下保溫5min，加入0.5mL粗酶液，迅速混合均勻，準(zhǔn)確記錄從加入酶液到乳凝固的時間（s）。把40min凝固1mL 100g/L脫脂乳的酶量定義為一個索氏單位（SU）。

式中：K為每度OD660所相當(dāng)?shù)睦野彼崃浚?為4mL反應(yīng)液取出1mL測定（即4倍），T為反應(yīng)時間10min。

1.2.5 生長曲線和產(chǎn)酶曲線

1.2.5.1 生長曲線 將菌種接入麩皮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為3%，37℃振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22h測定菌體OD600值，繪制生長曲線。

1.2.5.2 產(chǎn)酶曲線 將菌種接入麩皮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為3%，振蕩培養(yǎng)37℃，分別在培養(yǎng)0、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60h測定發(fā)酵液的凝乳酶活力和蛋白水解力，并繪制產(chǎn)酶曲線。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.2.6.1 酶的最適作用溫度 分別在25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75℃下測定發(fā)酵液的凝乳活力，以最高酶活為對照，記為100%。

1.2.6.2 酶的熱穩(wěn)定性 分別在35、45、55、65℃下保溫10、20、30、40、50、60min，冷卻后在35℃測定發(fā)酵液的剩余凝乳活力，以最高酶活為對照，記為100%。

1.2.6.3 酶的最適作用pH 用0.1mol/L HCl和0.1mol/L NaOH將100g/L的脫脂乳調(diào)節(jié)到不同pH，在酶最適宜的凝乳溫度下測定發(fā)酵液的凝乳活力，以最高酶活為對照，記為100%。

1.2.6.4 酶的pH穩(wěn)定性 用0.1mol/L鹽酸和0.1mol/L氫氧化鈉將酶液調(diào)節(jié)到不同pH，在室溫下放置24h，再將酶液調(diào)回到最適pH，在酶最適溫度下測定發(fā)酵液的凝乳活力，以最高酶活為對照，記為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

將樣品梯度稀釋后涂布于酪蛋白平板培養(yǎng)基上，由于菌株產(chǎn)生凝乳酶作用于培養(yǎng)基中的酪蛋白而產(chǎn)生白色沉淀圈。一般情況下，沉淀圈越大越厚說明菌株產(chǎn)凝乳酶活力越高，蛋白活力高的菌株則會分解培養(yǎng)基中酪蛋白而產(chǎn)生透明圈。經(jīng)過初篩，從56個樣品中共分離得到6個產(chǎn)生沉淀圈的菌株，其菌落、沉淀圈和透明圈形態(tài)見圖1。將這些菌株分別在三種發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，凝乳酶和蛋白水解活力的測定結(jié)果如表1所示。

圖1 不同菌株在酪蛋白平板的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of different strains on the solid casein medium

表1 不同菌株在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶活力Table 1 Enzyme activities of different strains in different fermentation medium

由表1可以看出，在6株菌中，菌株GN 4.1在麩皮培養(yǎng)基中發(fā)酵時，凝乳活力最高可達1011.56SU/mL，此時蛋白水解活力為14.61U/mL，酶活比值最大。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征 菌株GN 4.1在酪蛋白平板上菌落邊緣不整齊且粘稠濕潤，微白色不透明，不光滑，有皺褶，中間隆起。顯微鏡鏡檢菌株為長桿狀，有芽孢，呈橢圓形，中生。液體靜置培養(yǎng)表面形成菌膜。菌株GN 4.1革蘭氏染色照片及掃描電鏡照片見圖2。

圖2 菌株GN4.1革蘭氏染色照片（1000×）及掃描電鏡照片（3000×）Fig.2 Gram stain（1000×）and electron micrograph（3000×）of strain GN 4.1

2.2.2 生理生化特征 菌株GN 4.1的部分生理生化實驗結(jié)果見表2，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]，初步確定其為芽孢桿菌屬。

表2 菌株GN 4.1部分生理生化特征Table 2 Partly biochemical and physiological characteristics of the strain GN 4.1

2.2.3 16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 采用芽孢桿菌16S rDNA特異保守序列引物對菌株GN 4.1進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳和分析，序列長度為1518bp。與已報道芽孢桿菌屬的16S rDNA序列進行比較后，從中選出部分菌株，根據(jù)其16S rDNA序列，利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建其進化樹，如圖3所示。

圖3 菌株GN 4.1與相關(guān)菌株系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree showing relationship between GN 4.1 and related strains

圖3表明菌株GN 4.1與解淀粉芽孢桿菌BCRC11601和解淀粉芽孢桿菌LCEP-1為同一簇，相似性在99%以上，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，最終確定菌株GN 4.1為解淀粉芽孢桿菌屬，命名為解淀粉芽孢桿菌GN 4.1。

2.3 生長曲線和產(chǎn)酶曲線

圖4 菌株GN 4.1生長曲線Fig.4 Growth curve of strain GN 4.1

圖5 菌株的產(chǎn)酶變化曲線Fig.5 Enzyme activity changes in fermentation process

由圖4可以看出，菌株GN 4.1在液體培養(yǎng)基中0～6h生長速率緩慢，這個時期為遲緩期；6～12h生長速率最快，這一階段即為指數(shù)生長期；12～20h菌體量隨時間延長基本保持平衡，這一階段為穩(wěn)定期。由產(chǎn)酶曲線（圖5）可以看出，菌株GN 4.1在遲緩期內(nèi)不產(chǎn)酶，12h后凝乳酶活力迅速增加，在發(fā)酵48h時凝乳酶活力達到最高，隨后凝乳酶活力略有降低；隨著凝乳酶產(chǎn)量的增加，蛋白水解力也逐漸增大，兩者變化趨勢基本相同，蛋白水解力在42h時達到最大，隨后逐漸降低。

2.4 酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 酶的最適作用溫度 圖6顯示了不同反應(yīng)溫度下發(fā)酵液的凝乳活力。結(jié)果表明，凝乳酶活力在反應(yīng)溫度為60℃時最高。以60℃時的酶活為標(biāo)準(zhǔn)，55℃時相對酶活性下降至81%，70℃時相對酶活性僅為20%，反應(yīng)溫度提高到75℃時，凝乳活力喪失。

圖6 不同溫度對凝乳酶活力的影響Fig.6 Effect of temperature on milk-clotting activity

2.4.2 酶的熱穩(wěn)定性 發(fā)酵液在不同溫度水浴處理后，測得的凝乳活力見圖7。結(jié)果表明，在35℃條件下處理時酶活力變化不大，加熱60min后，剩余酶活性為75.70%。在55℃條件下處理時酶活力下降較快，加熱40min后，剩余酶活性為8.40%，加熱50min后，酶活喪失。在65℃條件下處理時酶活力下降更快，加熱10min后，剩余酶活性為6.50%，加熱20min后，酶活喪失。

圖7 凝乳酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermo-stability of milk-clotting enzyme

2.4.3 酶的最適作用pH 不同pH下測定的凝乳酶活力結(jié)果見圖8。結(jié)果表明，在pH3.5～8.0的范圍內(nèi)，均有一定的凝乳活力，其中pH為5.5時凝乳活力最高。以pH5.5時的酶活為標(biāo)準(zhǔn)，在pH4.0～6.5的范圍內(nèi)，凝乳活力下降不多，相對活力均在74%以上。在pH4.0～6.5的范圍外，凝乳活力下降較多，pH為3.5時相對活力僅為9%，pH為8.0時相對活力僅為6%。

圖8 不同pH對凝乳酶活力的影響Fig.8 Effect of different pH on enzyme activity

2.4.4 酶的pH穩(wěn)定性 凝乳酶在不同pH條件下酶活穩(wěn)定性結(jié)果見圖9。結(jié)果表明，該酶pH3.5~8.5內(nèi)相對穩(wěn)定，pH小于3.5或pH大于8.5時酶活性下降較快，在pH3.0處理時，剩余酶活約為10%，在pH9.0處理時，剩余酶活僅為9%。

圖9 凝乳酶的pH穩(wěn)定性Fig.9 pH stability of milk-clotting enzyme

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本實驗通過酪蛋白培養(yǎng)基，從甘南牧區(qū)采集的土壤樣品中共篩選得到6株產(chǎn)生沉淀圈的細菌；采用麩皮培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和酪蛋白培養(yǎng)基復(fù)篩得到一株凝乳活力高、蛋白水解力低的菌株GN 4.1，菌株GN 4.1用麩皮培養(yǎng)基發(fā)酵48h時，凝乳活力最高可達1011.56SU/mL，此時蛋白水解活力為14.61U/mL。通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征結(jié)合16S rDNA序列分析，菌株GN 4.1被鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果表明該菌產(chǎn)生的凝乳酶的最適作用溫度為60℃，最適作用pH為5.5，65℃加熱10min后凝乳活力喪失，在pH3.5～8.5內(nèi)穩(wěn)定性較好?？傮w來看，菌株GN 4.1不僅發(fā)酵產(chǎn)酶周期短，而且具有能利用廉價原料-麩皮、凝乳酶活力高、蛋白水解力弱等特點，該菌株所產(chǎn)凝乳酶熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性較好、可操作性強，有用于乳品工業(yè)加工的潛力。該菌株也是國內(nèi)外首次分離到的產(chǎn)凝乳酶的解淀粉芽孢桿菌屬菌株。

3.2 討論

隨著世界奶酪產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，每年需要大量的凝乳酶。動物凝乳酶的缺乏使得微生物凝乳酶替代品的研究和開發(fā)成為熱點。本研究從甘肅甘南牦牛放牧區(qū)采集了大量土壤樣品，進行產(chǎn)凝乳酶微生物的分離。甘南牧區(qū)是甘肅省主要的畜牧業(yè)基地，地處青藏高原東北邊緣，大部分地區(qū)在3000m以上，四季溫差大，紫外線強度大。當(dāng)?shù)靥厥獾牡乩?、氣候和人文環(huán)境為微生物群落的多樣化和繁衍進化提供了條件，這里必然蘊藏著具有獨特酶類和特殊的代謝途徑的微生物。本研究從牦牛牧區(qū)采集的大量土壤樣品中共分離得到6個產(chǎn)生沉淀圈的菌株，復(fù)篩后得到一株高產(chǎn)凝乳酶細菌GN 4.1，形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rDNA序列同源分析結(jié)果表明它是一株解淀粉芽孢桿菌。目前關(guān)于解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）在食品工業(yè)上應(yīng)用的報道主要集中在其能產(chǎn)生α-淀粉酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、抗菌脂肽、豆豉溶栓酶等[14-17]，對于產(chǎn)凝乳酶尚未見報道，菌株GN 4.1的發(fā)現(xiàn)豐富了凝乳酶產(chǎn)生菌的資源庫。

在實際生產(chǎn)中，縮短發(fā)酵周期，設(shè)備的利用率就會大大提高。菌株GN 4.1的生長曲線顯示其對數(shù)生長期在培養(yǎng)6～12h，而在發(fā)酵過程中其產(chǎn)酶高峰期卻在發(fā)酵12h以后，且隨著發(fā)酵時間的增加產(chǎn)酶活力也不斷增加，到48h達到最高，比目前已報道的產(chǎn)凝乳酶真菌米黑毛霉（Mucor mihei）和微小毛霉（Mucor pusillus）發(fā)酵周期短[18-20]；與已報道的產(chǎn)凝乳酶細菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）相比，菌株GN 4.1不僅發(fā)酵產(chǎn)酶周期短，而且具有能利用廉價原料-麩皮、凝乳酶活力高、蛋白水解力弱等特點[7-10]。在后續(xù)實驗中可對其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進一步優(yōu)化，以提高其凝乳活力，降低蛋白水解力。

酶學(xué)性質(zhì)與酶能否工業(yè)化應(yīng)用有很大關(guān)系，不同菌株來源的凝乳酶的酶學(xué)性質(zhì)有很大差異。pH和溫度是影響凝乳糖酶活性的重要因子，過高或過低會改變凝乳酶蛋白的構(gòu)象，甚至?xí)?dǎo)致凝乳酶變性失活；當(dāng)pH改變不劇烈時，凝乳酶雖尚未變性，但活力會受到一定影響，從而影響酶制劑在生產(chǎn)中的使用效果。根據(jù)國際乳業(yè)聯(lián)合會（International Dairy Federation，IDF）要求[21]，生產(chǎn)用凝乳酶需具備下列特征：凝乳活性與蛋白水解活性比值（C/P）高；凝乳活性對pH的依賴性較??；在干酪加工中應(yīng)用的溫度和pH條件下活性穩(wěn)定；在乳清加工中的熱穩(wěn)定性較低；貯藏期間穩(wěn)定性好。菌株GN 4.1凝乳酶的最適作用溫度與微小毛霉凝乳酶同為60℃，均高于小牛皺胃酶。熱穩(wěn)定性與微小毛霉凝乳酶類似，65℃加熱10min后凝乳活力喪失；凝乳酶的最適作用pH為5.5，與微小毛霉凝乳酶接近，略低于小牛皺胃酶；菌株GN 4.1凝乳酶的在pH3.5～8.5范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好，說明它適宜的pH范圍比小牛皺胃酶和微小毛霉凝乳酶要寬[22-23]。關(guān)于菌株所產(chǎn)凝乳酶的其它酶學(xué)性質(zhì)、凝乳酶的氨基酸序列、活性位點和結(jié)構(gòu)預(yù)測等有待于進一步研究。

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Study on isolation，identification of Bacillus amyloliquefaciens producing chymosin and enzyme properties

ZHANG Wei-bing1，2，3，GAN Bo-zhong1，2，3，*，LIANG Qi1，2，3，MI Lan1，2，3，ZHANG Yan1，2，3
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Gansu Provincial Key Laboratory of Functional Dairy，Lanzhou 730070，China；3.Gansu Casein Engineering Technical Research Center，Lanzhou 730000，China）

The casein culture medium was used to isolate milk-clotting enzyme producing bacteria from soil of yak grazing district in Gannan County.Strain identification was carried out based on the morphology，physiology，biochemical test and 16S rDNA sequences analysis，and the property of the milk-clotting enzyme produced by the strain was studied.Six bacteria producing milk-clotting enzyme were screened out.Furthermore，one bacterium GN4.1 had the highest milk-clotting enzyme activity and the lowest protein hydrolyzed enzyme activity，identified as Bacillus amyloliquefaciens.The milk-clotting enzyme activity and the protein hydrolyzed enzyme activity of GN 4.1 was 1011.56SU/mL and 14.61U/mL after fermentation for 48h，respectively.The optimal reaction condition for milk-clotting enzyme was at 60℃，pH5.5.The activity was stable at pH ranging from 3.5 to 8.5 but totally lost after heating at 65℃for 10min.The milk-clotting enzyme produced by strain GN 4.1 might have the potential applicatin in dairy industry.

Bacillus amyloliquefaciens；milk-clotting enzyme；enzyme properties

TS201.3

A

1002-0306（2012）07-0172-06

2011－07－14 *通訊聯(lián)系人

張衛(wèi)兵（1974-），男，副教授，博士，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)。

國家863計劃（2011AA100903）；甘肅省科技重大專項項目（0702NKDA034）；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新基金（GAU-CX1107）。