沙煲暗羅根乙醇提取物的抗氧化活性和抗菌活性研究

王吉鴻， 紀明慧， 舒火明，2*， 宋小平， 肖梓迪

（1.海南師范大學，省部共建－熱帶藥用植物化學教育部重點實驗室，海南 ?？?571158；2.海南經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學院，海南 海口 571127）

沙煲暗羅Polyalthia consanguinea是番荔枝科Annonaceae暗羅屬植物［1］，主要分布于東半球的熱帶及亞熱帶地區(qū)，我國主要分布于云南、廣東、廣西南部、海南及臺灣。暗羅屬植物在民間已作藥用，具有行氣止痛、行氣散結(jié)的功效，在海南島黎族地區(qū)治療氣滯腹痛、胃疼、痛經(jīng)、梅核氣等［2］。近幾年來，化學和藥學工作者對暗羅屬植物進行了一系列的研究工作，發(fā)現(xiàn)從部分植物中得到的化合物具有一定的抗腫瘤［3］，抗瘧疾［4］，抗肺結(jié)核［4］，抗蟲［5］等藥理活性。但作為海南特有植物的沙煲暗羅，對其研究未見相關(guān)文獻報道。本實驗擬對沙煲暗羅根部的乙醇提取物進行抗氧化活性和抑菌活性研究，從而為沙煲暗羅的進一步開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 植物材料 沙煲暗羅采自海南省昌江縣霸王嶺森林公園，經(jīng)海南師范大學生命科學院鐘瓊?cè)锢蠋熻b定為番荔枝科暗羅屬植物沙煲暗羅Polyalthia consanguinea，樣本保存在海南省熱帶藥用植物化學重點實驗室。

1.1.2 供試菌種 枯草芽孢桿菌(Bacillus sutbtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌 (Escherichia coli)、黑曲霉(Aspergillus nigar)由海南師范大學生命科學學院微生物教研室提供。

1.1.3 試劑 石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醇(均為分析純，天津市化學試劑一廠)；過氧化氫(分析純，西隴化工股份有限公司)；七水合硫酸亞鐵(分析純，廣州化學試劑廠)；抗壞血酸(Vc)(分析純，廣東汕頭轉(zhuǎn)寧化工廠)；鄰二氮菲(分析純，天津市化學試劑一廠)；二甲基亞砜(分析純，天津市化學試劑一廠)；三羥甲基氨基甲烷(分析純，上海山浦化工有限公司)；1，1-二苯基-2三硝基苯肼(DPPH)(美國Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))；瓊脂、營養(yǎng)肉湯、改良馬丁購于廣東湛江市林達化玻儀器有限公司。

1.1.4 儀器 超聲波清洗器(KQ2200型，昆山市超聲儀器有限公司)；pH計(pHS-3C型，上海康儀儀器有限公司)；電子天平(BS124S型，賽多利斯科學儀器有有限公司)；紫外可見分光光度計(UV2600，北京普析通用儀器責任有限公司)；手輪式自動型不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-30KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)、智能生化培養(yǎng)箱(SPX-250，寧波海曙賽福實驗儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙醇粗提物和不同極性萃取物的制備 將沙煲暗羅根風干，粉碎稱質(zhì)量1 kg，用75%乙醇加熱回流3次，每次2 h，合并提取液減壓濃縮得到乙醇浸膏；將浸膏懸濁于水中再依次用石油醚(60～90℃)、三氯甲烷、乙酸乙酯萃??；減壓濃縮分別得石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物，各浸膏冷凍干燥。

1.2.2 清除羥基自由基(OH·)能力 按參考文獻［6］方法進行實驗。準確稱取不同部位的樣品溶液10 mg，用二甲基亞砜溶解，分別配制成75、100、125、175、230 μg/mL 的溶液備用。在 10 mL 棕色量瓶中依次加入0.4 mL鄰二氮菲 (5 mmol/L)、1 mL醋酸緩沖溶液 (50 mmol/L pH6.0)、0.4 mL FeSO4(7.5 mmol/L)溶液、0.4 mL H2O2(1%)和不同體積的樣品溶液，用二甲基亞砜定容至10 mL，然后于37℃恒溫水浴反應60 min。在536 nm處測量吸光值A(chǔ)，平行3次。按下公式計算清除率:

(1)式中:A0為不加雙氧水，而加入樣品時的吸光度；A1為加入雙氧水，而不加入樣品時的吸光度；A2為加入雙氧水和樣品時的吸光度。

1.2.3 清除DPPH自由基能力 按參考文獻［7-10］方法進行實驗。準確稱取不同部位的樣品液10 mg，用二甲基亞砜溶解，分別配制成 75，100，125，175，230 μg/mL的溶液備用。取不同體積樣品溶液于10 mL棕色量瓶中，加入1 mL DPPH溶液，用二甲基亞砜定容至10 mL，室溫避光下反應30 min。其中1 mL DPPH和9 mL二甲基亞砜A1，VmL樣品，1 mL DPPH和(9-V)mL二甲基亞砜為A2。在517 nm處測定其吸光值A(chǔ)，平行三次。

(2)式中:A1為空白吸收值(t=0 min)；A2為反應30 min后的吸光度值

1.2.4 常規(guī)擴散法測定抑菌效果 配制不同質(zhì)量濃度的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取物，分別考察其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉的抑制作用，采用常規(guī)擴散法［11］即用配好的不同質(zhì)量濃度梯度的待測溶液浸透濾紙片(濾紙片直徑d=12.56 mm)；待其自然晾干后放入接有菌種的培養(yǎng)皿中。利用其擴散作用，使濾紙片上的藥品溶入培養(yǎng)基中。菌種在經(jīng)過24 h或48 h培養(yǎng)后(細菌培養(yǎng)24 h、真菌培養(yǎng)48 h)，觀察培養(yǎng)皿中有無抑菌圈，每個質(zhì)量濃度三個水平(n=3)，采用十字交叉法測量其直徑，然后取平均值，測量其抑菌圈大小，由抑菌圈的有無來證明其是否有抑菌作用，并由抑菌圈大小的比較說明抑菌作用的強弱。并用固體平板培養(yǎng)基稀釋法［13］測定最小抑菌質(zhì)量濃度MIC。

2 結(jié)果與討論

2.1 沙煲暗羅根乙醇提取物的抗氧化活性結(jié)果

2.1.1 清除羥基自由基能力 由圖1和表1得出，四個部位對羥基自由基都有一定的清除能力，樣品質(zhì)量濃度增大，清除羥基自由基能力增強。從IC50值可以看出，乙酸乙酯萃取物的清除能力最強，水相最弱，且乙酸乙酯、三氯甲烷和石油醚萃取物的清除能力強于Vc，水相部位較Vc弱。

圖1 清除羥基自由基的能力Fig.1 Hydroxyl radical scavenging activity

表1 清除羥基自由基(OH·)的IC50值Tab.1 IC50values for scavenging hydroxyl radical

2.1.2 清除DPPH自由基能力 由圖2和表2得出，4個部位對DPPH都有一定的清除能力，樣品質(zhì)量濃度增大，樣品清除DPPH的能力增強。從IC50值可以看出，乙酸乙酯萃取物的清除能力最強，水相最弱，且4種萃取物的清除能力強于Vc。

綜上所述，4個部位都有一定的抗氧化活性，與Vc相比，乙酸乙酯萃取物IC50最小，三氯甲烷萃取物次之，再次是石油醚萃取物，水相最大。

圖2 清除DPPH的能力Fig.2 The activity of scavenging DPPH free radical

表2 清除DPPH的IC50值Tab.2 IC50values for scavenging DPPH free radical

2.2 沙煲暗羅根乙醇提取物抑菌實驗 不同質(zhì)量濃度的沙煲暗羅根乙醇提取物的石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物和乙酸乙酯萃取物和水相部位對枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉的抑制作用，結(jié)果見表3。可以看出，三氯甲烷萃取物對枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，而對黑曲霉沒有抑制作用，石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物和乙酸乙酯萃取物和水相部位對以上4種菌種的沒有抑制作用。三氯甲烷萃取物的最小抑菌濃度見表4。

表3 沙煲暗羅根乙醇提取物的抑菌效果Tab.3 The antimicrobial effect of extracts from the root of Polyalthia consanguinea

表4 三氯甲烷萃取物的最小抑菌質(zhì)量濃度Tab.4 The MIC values of the chloroform extract

結(jié)果可知，沙煲暗羅根乙醇提取物石油醚、乙酸乙酯萃取物和水相部位對枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉無明顯抑制作用，三氯甲烷萃取物對枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，對黑曲霉無抑制作用。從表4看出，三氯甲烷萃取物質(zhì)量濃度為20 mg/mL時，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌不生長，其MIC為20 mg/mL，同時，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為40 mg/mL。

3 討論

沙煲暗羅根乙醇提取物不同極性萃取物都有一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯萃取物對羥基自由基和DPPH活性最好，其IC50值分別為110.8、156.5 μg/mL，三氯甲烷萃取物次之，再次是石油醚萃取物，水相活性最后；同時，三氯甲烷萃取物有明顯的抑菌效果，對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌最小抑菌質(zhì)量濃度均為20 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為40 mg/mL。這表明通過萃取可以有效富積沙煲暗羅根抗氧化和抗菌成分，并且并非單一成分。這一結(jié)果為之后對其有效成分的分離鑒定提供了導向，同時為沙煲暗羅根中的天然抗氧化和抑菌物質(zhì)及以其為原料的藥品、食品的開發(fā)和研究提供了依據(jù)。本實驗填補了沙煲暗羅抗氧化和抑菌研究的空白，為進一步研究該植物提供了基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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