RP-HPLC法測(cè)定靈芝膠囊中腺苷

姜麗珍， 胡端龍， 奚靜芳， 沈 瑩， 張國(guó)明

（上海市中藥研究所，上海 201401）

靈芝膠囊是由靈芝藥材提取的單味制劑，具有寧心安神、健脾和胃的功效。用于失眠健忘、身體虛弱、神經(jīng)衰弱等癥［1］。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)“中藥成方制劑”第四冊(cè)，但無(wú)定量測(cè)定項(xiàng)。2010年版中國(guó)藥典中，靈芝藥材有定量測(cè)定項(xiàng)，但其測(cè)定對(duì)象是以葡萄糖為對(duì)照品的紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定靈芝多糖［2］。顯然該方法缺乏專一性，特別是在含有淀粉類輔料的制劑中會(huì)引起干擾，且意義不大。為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，有必要建立特異性更高的定量測(cè)定方法。

靈芝中的腺苷是一種活性很強(qiáng)的物質(zhì)，是近年所發(fā)現(xiàn)的有效成分之一，它能提高血液供氧能力和加速血液微循環(huán)，提高血液對(duì)心腦的供氧能力［3］。靈芝膠囊中腺苷檢測(cè)近年較多采用高效液相色譜法［4-8］，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)靈芝膠囊品種特點(diǎn)，對(duì)流動(dòng)相選擇以及樣品前處理等方面作了部分改進(jìn)，建立了靈芝膠囊高效液相色譜法測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀，G1365B MWD檢測(cè)器。

1.2 藥品和試劑 腺苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)879-200202)；樣品:靈芝膠囊(上海雷允上藥業(yè)有限公司提供，批號(hào) 100301，100315，100327)；乙腈、甲醇為色譜純，試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫30℃；流動(dòng)相乙腈-水(7 ∶93)，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，體積流量1.0 mL/min，理論塔板數(shù)不低于5000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取腺苷對(duì)照品適量，精密稱定，加15%甲醇制成每1 mL含2 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱定約1.5 g，置25 mL量瓶中，加15%甲醇約20 mL，超聲15 min，取出，放冷，加15%甲醇至刻度，搖勻，過(guò)0.45 m濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按工藝處方，制備不含靈芝的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn) 照上述色譜條件，精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀。在腺苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，且與其它成分的色譜峰分離良好。而陰性液在腺苷保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，不存在干擾(見(jiàn)圖1)。

圖1 靈芝膠囊中腺苷測(cè)定高效液相色譜圖

2.6 線性關(guān)系的考察 稱取腺苷對(duì)照品適量，精密稱定，加15%的甲醇制成質(zhì)量濃度為1.9050 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別精密吸取5、10、20 μL；另15%的甲醇制成質(zhì)量濃度為16.0000 μg/mL 的對(duì)照品溶液，分別精密吸取 5、10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得峰面積值。

以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=3099.1X－7.2753，r=0.9995。結(jié)果表明腺苷進(jìn)樣量在0.0095～0.1600 μg范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取質(zhì)量濃度為1.91 μg/mL的腺苷對(duì)照品溶液20 μL，按上述色譜條件，重復(fù)測(cè)定6次，記錄峰面積，結(jié)果分別為:101.0、102.0、99.44、103.5、100.5、103.1，RSD為1.70%(n=6)，結(jié)果表明本試驗(yàn)精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為100301的樣品，按供試品方法制備，按上述色譜條件，于 0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果RSD為1.94%(n=7)，結(jié)果表明供試品溶液中含有的腺苷在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為100301的樣品，一式6份，按供試品方法制備，按上述色譜條件測(cè)定。測(cè)定的平均含有量為10.30 μg/粒，RSD 為1.89%(n=6)，結(jié)果表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.10 回收率試驗(yàn) 取批號(hào)為100301的樣品適量，一式9份，取0.75 g，精密稱定，加入一定量的對(duì)照品，按供試品制備方法制備，按上述色譜條件注入液相色譜儀測(cè)定，見(jiàn)表1。結(jié)果平均回收率為99.60%，RSD為1.28%(n=9)，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定可靠。

表1 回收率試驗(yàn)(n=9)

2.11 樣品測(cè)定 取樣品(1) 100301；樣品(2) 100315；樣品(3)100327，按供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件，精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

報(bào)道的高效液相色譜法測(cè)定靈芝膠囊中腺苷的流動(dòng)相，主要采用甲醇或乙腈與磷酸溶液［6］或磷酸二氫鉀溶液［5，7］或磷酸緩沖溶液［4，8］組合而成，而本實(shí)驗(yàn)采用簡(jiǎn)單的乙腈-水(7∶93)系統(tǒng)，腺苷分離狀況良好，保留時(shí)間也適中，更為關(guān)鍵的是它避免了鹽類或酸類成分的使用，這對(duì)延長(zhǎng)分析色譜柱使用壽命有著非常實(shí)在的意義。

靈芝膠囊中腺苷含有量較低，每粒在微克量級(jí)水平，故在樣品前處理方法確定方面，尤其需要重視實(shí)驗(yàn)篩選優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)比較了樣品回流提取與超聲提取效果，發(fā)現(xiàn)超聲的明顯優(yōu)于回流方法；在提取溶媒選擇上，平行比較了15%、50%和90%甲醇的實(shí)際提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15%甲醇提取者含有量高、雜質(zhì)少、峰形好。

對(duì)比現(xiàn)有的靈芝膠囊腺苷測(cè)定報(bào)道，發(fā)現(xiàn)提取溶媒出現(xiàn)多種選擇，既有使用 90%甲醇［6，8］的，也有采用水［4］的，甚至還有用流動(dòng)相［5，7］(甲醇-磷酸二氫鉀，10 ∶90)來(lái)提取的，對(duì)于這種狀況，這可能是報(bào)道者僅對(duì)自己被測(cè)的某個(gè)具體產(chǎn)品選定溶媒，而實(shí)際情況是，不同生產(chǎn)廠家的靈芝膠囊，其所含輔料種類肯定有所不同(部頒標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)輔料種類作出明確規(guī)定)，這就有可能產(chǎn)生上述采用不同溶媒的情況。

靈芝藥材的水提取得率不高，必然造成膠囊中含較多量的輔料，這些輔料對(duì)微量腺苷測(cè)定究竟會(huì)產(chǎn)生怎樣的影響目前尚不清楚，盡管報(bào)道者均作過(guò)回收率測(cè)定，但根據(jù)中藥制備過(guò)程實(shí)際情況，這種回收率并不能完全反映出膠囊制備后大量不同類輔料對(duì)微量腺苷所產(chǎn)生的吸附。報(bào)道［4］稱9家膠囊產(chǎn)品的腺苷量差異很大(每粒12～137 μg)，顯然這主要是產(chǎn)品質(zhì)量高低問(wèn)題，但也不能排除不同廠家使用不同輔料所產(chǎn)生的測(cè)定偏差。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)［S］，WS3-B-0753-91.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:174.

［3］陳國(guó)良，陳曉清.靈芝有效成分研究綜述［J］.中國(guó)食用菌，1995，14(4):7-9.

［4］邱文煒，翁雪萍.靈芝膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及質(zhì)量評(píng)價(jià)［J］.中藥材，2005，28(9):827-828.

［5］李開(kāi)志，雷灼雨，巴國(guó)際.RP—HPLC法測(cè)定靈芝膠囊中腺苷的含量［J］.中國(guó)藥房，2007，18(30):2371-2372.

［6］李 軍，任孝德，魏晨陽(yáng).HPLC法測(cè)定靈芝膠囊中腺苷的含量［J］.中醫(yī)研究，2008，21(9):91-92.

［7］嚴(yán) 華，張聿梅，宋金翠，等.靈芝膠囊中腺苷、腺嘌呤的TCL鑒別及腺苷的HPLC法含量測(cè)定［J］.藥物分析雜志，2008，28(11):1800-1803.

［8］胡文璐，余 俊，黃宗雯.反相HPLC法測(cè)定靈芝膠囊中腺苷的含量［J］.黑龍江醫(yī)藥，2009，22(5):599-601.