液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定肉中丙硫咪唑及其代謝物

付曉芳，王 鵬，趙曉亞，李 晶，尚吟竹，葉 誠(chéng)

(湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，湖北 武漢 430050)

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定肉中丙硫咪唑及其代謝物

付曉芳，王 鵬，趙曉亞，李 晶，尚吟竹，葉 誠(chéng)

(湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，湖北 武漢 430050)

建立同時(shí)測(cè)定肉中丙硫咪唑及其代謝物丙硫咪唑砜、丙硫咪唑亞砜、2-氨基丙硫咪唑砜的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。樣品用乙腈提取，液液分配凈化后，XDB-C18色譜柱分離，流動(dòng)相乙腈:0.1%甲酸溶液(1:1，V/V)，外標(biāo)法定量。丙硫咪唑及其3種代謝物的檢出限均為0.010mg/kg，在0.010～1.0mg/L范圍內(nèi)其質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.99。添加量為0.010～0.050mg/kg時(shí)的回收率為82.3%～97.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%～12.9%。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、香腸中丙硫咪唑及其代謝物的定性、定量檢測(cè)。

丙硫咪唑；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；代謝物；肉

丙硫咪唑(albendazole，ABZ)，又名腸蟲清、阿苯達(dá)唑、抗蠕敏，是一種高效、廣譜、低毒的苯咪唑類抗蠕蟲藥，對(duì)肝蟲、吸蟲、絳蟲和胃腸道線蟲均有顯著作用。由于丙硫咪唑是治療線蟲和絳蟲的首選藥物，因此使用比較頻繁，很容易造成動(dòng)物組織的殘留，危害人體健康。丙硫咪唑在體內(nèi)會(huì)代謝為丙硫咪唑砜(albendazole sulfone，ABZ-SO)、丙硫咪唑亞砜(albendazole sulfoxide，ABZ-SO2)和2-氨基丙硫咪唑砜(albendazole-2-aminosulfone，ABZ-NH2)[1]。歐盟和我國(guó)均規(guī)定丙硫咪唑及其代謝物的總和在動(dòng)物體內(nèi)的最大殘留限量為100μg/kg，為了滿足歐盟和我國(guó)獸藥殘留監(jiān)控的要求，有必要建立同時(shí)測(cè)定丙硫咪唑及3種代謝物的檢測(cè)方法。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)丙硫咪唑及其代謝物的研究主要集中在動(dòng)物血漿中[2-5]，關(guān)于動(dòng)物組織[6-9]、水產(chǎn)品[10-11]和飼料[12]中丙硫咪唑及其代謝物的報(bào)道較少，徐雪等[13-14]研究了組織中丙硫咪唑亞砜和砜的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，沒有丙硫咪唑及其三種代謝物的方法報(bào)道。我國(guó)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN 0207—93《出口肉中丙硫咪唑殘留量檢驗(yàn)方法》[15]，用配有熒光檢測(cè)器的液相色譜儀測(cè)定豬肉中的丙硫咪唑母體含量，而不是檢測(cè)丙硫咪唑及其3種代謝物的含量。本實(shí)驗(yàn)用乙腈勻質(zhì)提取肉及肉制品中丙硫咪唑及其代謝物，液液萃取去除提取液中的油脂，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)，旨在為其標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、香腸 武漢市場(chǎng)。

標(biāo)準(zhǔn)品丙硫咪唑、丙硫咪唑砜、丙硫咪唑亞砜和2-氨基丙硫咪唑砜(純度≥97%) Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈(色譜純) 美國(guó)Fisher公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1100 液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；API 4000Q 三級(jí)四級(jí)桿質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源) 美國(guó)AB公司；Harvard pump Ⅱ針泵 美國(guó)Varian公司；Allegra X-12R離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；渦旋混合器 德國(guó)IKA公司；高速均質(zhì)器 美國(guó)Tomtec公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本Eyela公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取丙硫咪唑及其3種代謝物標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，至于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配成1.0g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋成1×10-3g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品制備

準(zhǔn)確稱取肉樣5.0g于50mL離心管中，加入15mL乙腈，高速勻漿，3500r/min離心，上清液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉轉(zhuǎn)入梨形瓶中。10mL乙腈重復(fù)上述操作，乙腈層減壓濃縮至干。用2mL 90%乙腈溶解殘?jiān)尤?mL乙腈飽和的正己烷，渦旋，棄去正己烷層，下層過0.2μm濾膜，待進(jìn)樣測(cè)定。

1.3.3 分析條件

色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipes XDB-C18液相色譜柱(150mm×4.6mm i.d.，5μm)；預(yù)柱為Phenomenex C18(3.0mm i.d.×4.0mm)；流動(dòng)相：乙腈:0.1%甲酸(1:1，V/V)。流速250μL/min，進(jìn)樣量5μL，柱溫25℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)，正離子多反應(yīng)監(jiān)控(multi-reactions monitoring，M R M)掃描模式，離子源溫度4 8 0℃，離子源電壓5200V；霧化氣、氣簾氣和輔助氣為N2，其中霧化氣為0.08MPa，氣簾氣壓為0.05MPa，輔助氣流速為6L/min。MRM監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞電壓及去簇電壓見表1。

表1 丙硫咪唑及其代謝物的質(zhì)譜優(yōu)化條件Table 1 Optimal MS/MS conditions of albendazole and its metabolites

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

將丙硫咪唑及其3種代謝物標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用流動(dòng)注射直接進(jìn)樣，通過全掃描方式確定其母離子，再對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描得到碎片離子，通過優(yōu)化條件，得到二級(jí)質(zhì)譜圖。通過多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)選擇相對(duì)豐度較高的離子對(duì)為定性定量離子對(duì)，并對(duì)其去簇電壓、碰撞電壓等條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用Agilent Eclips XDB-C18為色譜柱，用不同的流動(dòng)相對(duì)丙硫咪唑及其代謝物進(jìn)行分離，結(jié)果顯示：乙腈:0.1%甲酸溶液(1:1，V/V)為最佳分離體系，在保證有很好的分離效果前提下，運(yùn)行一個(gè)樣品大約需要10min，優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的其他分離體系效果。樣品分離譜圖如圖1所示。

圖1 丙硫咪唑及其3種代謝物的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram showing separaion of albendazole and its metabolites

2.3 樣品凈化方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用正己烷液液萃取的方法對(duì)提取液進(jìn)行去脂凈化，去除提取液中脂肪等雜質(zhì)。丙硫咪唑與2-氨基丙硫咪唑砜性質(zhì)差別較大，丙硫咪唑是脂溶性物質(zhì)，而2-氨基丙硫咪唑砜是水溶性物質(zhì)，在凈化時(shí)溶劑的選擇會(huì)影響丙硫咪唑及其代謝物的回收率。為最大效率的去除雜質(zhì)并保證丙硫咪唑及其代謝物的損失最小，對(duì)不同比例的乙腈-水進(jìn)行考察，通過測(cè)定乙腈-水中丙硫咪唑及其代謝物的剩余量確定最佳的乙腈-水比例。具體方法：取0.1mL 100ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，N2吹干，加1mL不同比例的乙腈-水溶液溶解殘?jiān)?，然后?mL乙腈飽和的正己烷進(jìn)行液液萃取，棄去正己烷層，然后用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析乙腈-水溶液中丙硫咪唑及其代謝物的量，計(jì)算回收率，從而確定最佳的乙腈-水的體積比為90:10。

2.4 線性關(guān)系及檢出限

用空白樣品提取液配制一系列不同質(zhì)量濃度(10、20、50、100、200、500、1000ng/mL)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液依次進(jìn)樣，以組分的峰面積(Y)對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度X/(ng/mL)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以此作為定量依據(jù)。結(jié)果表明：r＞0.99，丙硫咪唑及其代謝物有良好的線性關(guān)系，見表2。對(duì)相同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)試樣在同一日內(nèi)的不同時(shí)間進(jìn)行10次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，目標(biāo)化合物峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.75%～1.26%，說(shuō)明本方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

表2 丙硫咪唑及其代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)與檢出限Table 2 Linear equations, correlation coefficients and LODs of albendazole and its metabolites

2.5 回收率與精密度

取經(jīng)測(cè)定不含丙硫咪唑及其代謝物殘留的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、香腸樣品5.0g，分別添加0.010、0.025、0.050mg/kg含量水平，充分混合均勻，按照本方法進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，得到丙硫咪唑及其代謝物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。添加0.010～0.05mg/kg時(shí)的回收率為82.3%～97.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%～12.9%，符合國(guó)家質(zhì)檢總局《殘留分析質(zhì)量控制指南》的要求，可以用作肉及肉制品中丙硫咪唑及其代謝物殘留的檢測(cè)方法。

表3 樣品的回收率與精密度(n=10)Table 3 Spiked recovery rates and precision (RSD) of albendazole and its metabolites from different samples (n=10)

3 結(jié) 論

采用乙腈高速勻漿提取，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)肉中丙硫咪唑及其代謝物殘留的測(cè)定進(jìn)行研究。該方法線性范圍寬、線性關(guān)系好、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，為肉中丙硫咪唑及其代謝物殘留的檢測(cè)建立了檢測(cè)方法和確證方法。

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Determination of Albendazole and Its Metabolites in Meat by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

FU Xiao-fang，WANG Peng，ZHAO Xiao-ya，LI Jing，SHANG Yin-zhu，YE Cheng
(Center of Technology, Hubei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Wuhan 430050, China)

A liquid chromatography tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) method was established for simultaneous determination of albendazole and its metabolites including albendazole sulfone, albendazole sulfoxide and albendazole-2-aminosulfone in meat. Samples were extracted with acetonitrile and cleaned by liquid-liquid extraction. The separation of analytes was performed on an XDB-C18 column with acetonitrile and 0.1% formic acid solution as the mobile phase. The external standard calibration curve was used for quantification. The LOD of albendazole and its metabolites was 0.010 mg/kg. A good linear relationship between peak area and concentration in the range of 0.010－0.050 mg/kg for albendazole and its metabolites was achieved with a correlation coefficient of more than 0.99. The spiked recovery rates and relative standard deviations (RSDs)were 82.3%－97.6% and 4.9%－12.9%, respectively. The method was simple, fast, accurate, convenient, and applicable for qualitative and quantitative determination of albendazole and its metabolites.

albendazole；metabolites；LC-MS/MS；meat

TS255.7

A

1002-6630(2012)08-0180-04

2011-02-22

國(guó)家認(rèn)監(jiān)委標(biāo)準(zhǔn)修訂項(xiàng)目(2009B784r)

付曉芳(1980—)，女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩-mail：fuxf@hbciq.gov.cn