響應(yīng)面法優(yōu)化毛葡萄酒泥中L(＋)-酒石酸提取工藝

米 思，李 華*，劉 晶

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；

2.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

響應(yīng)面法優(yōu)化毛葡萄酒泥中L(＋)-酒石酸提取工藝

米 思1，李 華2,*，劉 晶2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；

2.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化毛葡萄酒泥提取L(＋)-酒石酸工藝中的酸浸和沉降兩個技術(shù)參數(shù)。結(jié)果得出酸浸的最佳工藝參數(shù)為：溫度82℃、時間7min、37%鹽酸8mL(以100mL毛葡萄酒泥計)；沉降的最優(yōu)工藝參數(shù)為：CaCl2質(zhì)量濃度50g/L、pH6.64、反應(yīng)時間2.4h。在此條件下，毛葡萄酒泥中L(＋)-酒石酸的實際酸浸提量為41.63g/L，實際提取回收率可達87.64%。

毛葡萄；酒泥；L(＋)-酒石酸；響應(yīng)面法；提取工藝

毛葡萄(Vitis quinquangulanis Rehd.)又名野葡萄、五角葉葡萄、雞葡萄，是原產(chǎn)于我國本土的珍稀野生釀酒葡萄品種之一，是我國葡萄屬東亞種群中蘊藏量最大、分布最廣的一個野生種[1]，在中國秦嶺、秦山以南至廣西境內(nèi)均有分布，其漿果具有酸高、糖低、單寧含量高三個顯著特點。L(＋)-酒石酸(又名右旋-2,3-二羥基丁二酸)是一種天然有機酸，主要存在于葡萄及羅望子果實中，是葡萄酒中主要的有機酸之一，也是酒石酸四種異構(gòu)體中最有價值的一種，在食品、醫(yī)藥及化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[2-3]。

我國L(＋)-酒石酸的生產(chǎn)起步較晚，80年代開始才進行探索性的L(＋)-酒石酸試驗研究，已形成規(guī)模的生產(chǎn)廠家較少，主要集中在江浙一帶。目前存在的L(＋)-酒石酸的生產(chǎn)方法主要有4種：抽提法、糖質(zhì)發(fā)酵法、化學(xué)拆分法、酶合成法[4]。葡萄酒的釀造過程通常伴隨大量廢棄物的產(chǎn)生，如葡萄皮渣、酒泥、粗酒石等。抽提法是指直接從葡萄工業(yè)廢料中提取得到L(＋)-酒石酸，這是最早使用的方法，意大利、西班牙等西歐國家一般依據(jù)此法從粗酒石中提取L(＋)-酒石酸，但是目前國內(nèi)外對于以葡萄酒泥為原料提取L(＋)-酒石酸的方法罕有研究。酒泥是葡萄酒釀造過程中產(chǎn)生的一種重要的副產(chǎn)物，占葡萄鮮果干質(zhì)量的3.5%～8.5%，其中酒石酸含量約為100～150kg/t[5-6]，數(shù)量十分可觀。因此以葡萄酒工業(yè)酒泥為基礎(chǔ)，優(yōu)化L(＋)-酒石酸的提取工藝，對提高L(＋)-酒石酸產(chǎn)量及降低其生產(chǎn)成本具有重要意義。此外，本實驗選擇以野生毛葡萄酒泥為原料進行研究，不僅充分利用了毛葡萄含酸量高這一特點，而且為我國特色野生植物資源的深度開發(fā)利用創(chuàng)造了新的途徑，對改善山區(qū)環(huán)境和解決山區(qū)農(nóng)民貧困問題具有重要意義。

響應(yīng)曲面法是一種優(yōu)化試驗條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法，被廣泛的應(yīng)用于食品工業(yè)及化學(xué)工業(yè)中[7-10]。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法對毛葡萄酒泥中L(＋)-酒石酸的提取工藝進行優(yōu)化，以期為L(＋)-酒石酸的大規(guī)模生產(chǎn)及研究提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛葡萄酒泥：由廣西都安密洛陀野生葡萄酒有限公司提供，蒸餾，放入冰箱，4℃保存?zhèn)溆?；冰醋酸、氫氧化鈉、偏釩酸鈉、酒石酸、濃鹽酸、碳酸鈣、氯化鈣(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

723A型可見分光光度計、pHS-3C型pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；JB-2型恒溫磁力攪拌器 上海智光儀器儀表有限公司；GSY-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋 北京醫(yī)療設(shè)備廠有限責(zé)任公司；TDL-40B型離心機 上海安亭科學(xué)儀器有限公司；101A-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海實驗儀器廠有限公司；電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 L(＋)-酒石酸的提取工藝

工藝流程：毛葡萄酒泥→酸浸→離心→沉降→過濾→酸解→脫色→結(jié)晶→L(＋)-酒石酸晶體。

操作要點：取預(yù)先經(jīng)過蒸餾處理的毛葡萄酒泥100mL，按照實驗設(shè)計的方案進行L(＋)-酒石酸的提取。酸浸結(jié)束后，離心、去殘渣，得到上清液，向上清液中加入細粉狀CaCO3，邊加邊攪拌，使溶液達到pH7.0，將生成的酒石酸鈣移出，向余下的料液中按試驗設(shè)計加入CaCl2進行沉降、靜置后，將上述兩步生成的沉淀物合并，然后加入40℃熱水95mL及5mL、37%的鹽酸進行溶解，最后酸解液經(jīng)脫色、結(jié)晶，得到L(＋)-酒石酸，稱量并計算L(＋)-酒石酸的回收率，每組實驗重復(fù)3次，取平均值。計算L(＋)-酒石酸回收率：

式中：A為酸浸提液中L(＋)-酒石酸的質(zhì)量濃度/(g/L)；C為酸解液中L(＋)-酒石酸的質(zhì)量濃度/(g/L)。

1.3.2 L(＋)-酒石酸含量的測定方法

采用偏釩酸鈉溶液比色法[11]。在室溫條件下，500nm波長處測定L(＋)-酒石酸質(zhì)量濃度與吸光度的數(shù)學(xué)關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y＝0.2087x＋0.675，R2＝0.9982。該方程擬合度良好，可以用于L(＋)-酒石酸含量的計算。

1.3.3 L(＋)-酒石酸提取工藝優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗設(shè)計方案[12-15]，分別以L(＋)-酒石酸酸浸提量和L(＋)-酒石酸回收率為響應(yīng)值，利用Design Expert 7.0進行響應(yīng)面分析，優(yōu)化L(＋)-酒石酸的提取工藝。酸浸和沉降兩步的試驗因素和所選水平分別見表1、2。

表1 L(+)-酒石酸提取工藝酸浸工序響應(yīng)面試驗因素與水平表Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization extraction parameters used in the response surface

表2 L(+)-酒石酸提取工藝沉降工序響應(yīng)面試驗因素與水平表Table 2 Coded values and corresponding real values of the optimization precipitation parameters used in the response surface

2 結(jié)果與分析

2.1 酸浸工序試驗設(shè)計與優(yōu)化結(jié)果

Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果見表3，采用數(shù)據(jù)處理軟件Design Expert 7.0對表3進行擬合的二次模型方差分析，分析結(jié)果見表4。

當(dāng)P＜0.05時，表明該項指標(biāo)顯著。由表4可知該工序建立的回歸模型是極顯著的(P＜0.0001)，失擬項P＝0.2356＞0.05，不顯著；并且多元相關(guān)系數(shù)R2＝0.9992，調(diào)整R2＝0.9978，說明該模型與實際試驗擬合情況良好，可以用該回歸方程代替真實試驗點對試驗結(jié)果進行分析；變異系數(shù)CV＝1.73%，變異性較小。

回歸方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著程度，由F檢驗來判定，概率P(F＞Fα)的值越小，則說明該變量對響應(yīng)值影響的顯著程度越高。表4顯著性檢驗結(jié)果表明，一次項X1、X2、X3的影響極顯著，交互項X1X2影響顯著，X1X3影響極顯著，二次項X22影響極顯著。由此可知，各試驗因素對L(＋)-酒石酸酸浸提量的影響不是簡單的線性關(guān)系。

表3 L(+)-酒石酸提取工藝酸浸工序Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and corresponding experimental results for optimizing acid extraction parameters

表4 酸浸工序回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA of the regression equation describing acid extraction

對表3結(jié)果進行多元回歸分析，得到各因素對L(＋)-酒石酸酸浸提量(Y1)影響的多元二次回歸方程模型：

通過對上述多元二次回歸方程進行分析求解，得到L(＋)-酒石酸酸浸提的最優(yōu)工藝參數(shù)：酸浸溫度82.2℃、37% 鹽酸8.04mL、酸浸時間7.15min，考慮到實際操作的便利，將L(＋)-酒石酸的酸浸提最佳工藝條件修正為酸浸溫度82℃、37%鹽酸體積8mL、酸浸時間7min。在此條件下，L(＋)-酒石酸理論預(yù)測值為42.55g/L，實際測得的值為41.63g/L，表明該模型合理可行。

對酸浸提中有交互作用的因素所做的響應(yīng)面圖見圖1。由圖1a可知，在37%鹽酸體積不變的前提下，隨著溫度的升高，L(＋)-酒石酸的浸提量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。因為酒泥中的L(＋)-酒石酸主要是以酒石酸氫鉀和酒石酸鈣的形式存在的，溫度越高，酒石酸氫鉀的溶解度越大，反應(yīng)越容易進行，溫度的升高還能夠增加體系中分子的熱運動，從而導(dǎo)致L(＋)-酒石酸的浸提更容易進行。在溫度不變的條件下，隨著37%鹽酸體積的增加，L(＋)-酒石酸的浸提量先升高，在37%鹽酸體積接近8mL時，出現(xiàn)緩慢下滑趨勢。酒泥中主要存在3種有機酸：蘋果酸、酒石酸、檸檬酸，其中酒石酸是最強的酸。如果37%鹽酸加入過量，會同時使其他種類的有機弱酸浸提到溶液中，進而對L(＋)-酒石酸的浸提造成干擾，影響其提取量。

圖1 各兩因素交互作用對(＋)-酒石酸酸浸提量影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plot for the interactive effects between extraction temperature and the amount of 37% HCl addition or extraction time on the extraction rate of L(+)-tartaric acid

由圖1b可知，在酸浸時間不變的情況下，隨著酸浸溫度的升高，L(＋)-酒石酸的浸提量變化不明顯。在浸提溫度不變的條件下，隨著酸浸時間的延長，L(＋)-酒石酸的浸提量出現(xiàn)下降的趨勢，變化較明顯。葡萄酒泥是一種混合物，如果浸提時間過長，會使酒泥中的色素、糖等有機物充分浸出，由于這些有機物的干擾，L(＋)-酒石酸的浸提量開始下降。

2.2 沉降工序試驗設(shè)計與優(yōu)化結(jié)果

在前期得到的酸浸提最優(yōu)工藝參數(shù)的基礎(chǔ)上，以L(＋)-酒石酸回收率(Y2)為響應(yīng)值，采用相同的試驗設(shè)計方法及數(shù)據(jù)處理軟件對沉降工序工藝參數(shù)進行優(yōu)化，Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表5 L(＋)-酒石酸提取工藝沉降工序Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Box-Behnken design and corresponding experimental results for optimizing precipitation parameters

表6 沉降工序回歸模型方差分析Table 6 ANOVA of the regression equation describing CaCl2 precipitation

從表6可以看出，一次項X4、X6對響應(yīng)值影響極顯著，交互項X4X6、X5X6影響極顯著，此外，二次項X42和X52的影響也極顯著，這表明各因素均不同程度的對響應(yīng)值產(chǎn)生影響，因此本試驗的因素選擇合理。從表6還可知，對L(＋)-酒石酸沉降工序建立的模型是極顯著的(P＝0.0004)，失擬項(P＝0.5668＞0.05)不顯著；并且該模型R2＝0.9859，調(diào)整R2＝0.9604，說明響應(yīng)值的變化有98.59%來源于所選變量，回歸方程對實際試驗擬合程度較好。變異系數(shù)CV＝1.73%，說明建立的模型可以代替試驗真實點對響應(yīng)值進行預(yù)測和分析。

以L(＋)-酒石酸的回收率為響應(yīng)值(Y2)，各因素經(jīng)過二次回歸擬合后，得到的多元二次回歸方程為：

對回歸方程(2)進行進一步分析求解，得到沉降工序的最優(yōu)工藝條件：CaCl2質(zhì)量濃度50.15g/L、pH6.64、反應(yīng)時間2.36h，理論回收率為88.34%?？紤]到實際操作的便利，將得到最優(yōu)工藝參數(shù)修正為CaCl2質(zhì)量濃度50g/L、pH6.64、反應(yīng)時間2.4h，在此條件下進行試驗，得到L(＋)-酒石酸的回收率為87.64%，比理論預(yù)測值低0.79%，因此，利用響應(yīng)面分析法得到的沉降工序的工藝參數(shù)合理可靠，具有實際應(yīng)用價值。

L(＋)-酒石酸沉降工序中，對響應(yīng)值產(chǎn)生交互作用影響的各因素的響應(yīng)面圖分別見圖2。

圖2 各兩因素交互作用對L(＋)-酒石酸回收率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plot for the interactive effects between reaction time and the amount of CaCl2 addition or pH on the extraction rate of L(+)-tartaric acid

由圖2a可知，隨著CaCl2質(zhì)量濃度和反應(yīng)時間的增加，L(＋)-酒石酸的回收率均呈現(xiàn)上升趨勢，而且變化明顯。加入CaCl2的目的是為了將溶液中的酒石酸鹽類及酒石酸全部轉(zhuǎn)化為酒石酸鈣沉淀，因此CaCl2質(zhì)量濃度越大，反應(yīng)越充分，最終回收得到的酒石酸的量也就更多；同樣，隨著反應(yīng)時間的增加，反應(yīng)會更加徹底，也會使L(＋)-酒石酸的回收率上升。

圖2b直觀的反映了在CaCl2質(zhì)量濃度一定的條件下，pH值和反應(yīng)時間對L(＋)-酒石酸回收率產(chǎn)生的交互影響。在反應(yīng)時間不變的情況下，隨著pH值的變化，L(＋)-酒石酸的回收率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在pH值接近7時，回收率達到最大值。因為L(＋)-酒石酸的沉降反應(yīng)是在一個混合溶液體系中進行的，其中包含很多的膠體物質(zhì)，如色素、單寧與色素生成的絡(luò)合物、磷酸鐵等，這些膠體物質(zhì)在遠離它們的等電點處會發(fā)生絮凝作用而生成沉淀，因此pH值過大或是過小都可能影響L(＋)-酒石酸的回收。

3 結(jié) 論

通過響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化L(＋)-酒石酸提取過程中的酸浸和沉降兩個重要參數(shù)，最終得到L(＋)-酒石酸酸浸的最優(yōu)工藝參數(shù)為：酸浸溫度82℃、37%鹽酸體積8mL(以100mL毛葡萄酒泥計)、酸浸時間7min；沉降工序的最佳工藝參數(shù)為：CaCl2質(zhì)量濃度50g/L、pH6.64、反應(yīng)時間2.4h。照上述工藝條件進行驗證實驗，毛葡萄酒泥中L(＋)-酒石酸的實際酸浸提量為41.63g/L，實際回收率可達87.64%，與預(yù)測值接近，且重現(xiàn)性較好，證明優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

[1] 涂佳, 鄧學(xué)良, 李忠海, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化野生毛葡萄中原花青素醇提工藝的試驗[J]. 湖南林業(yè)科技, 2010, 37(1): 1-6.

[2] YALCIN D, OZCALIK O, ALTIOK E, et al. Characterization and recovery of tartaric acid from wastes of wine and grape juice industries[J].Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 2008, 94(3): 767-771.

[3] VERSARI A, CASTELLARI M, SPINABELLI U, et al. Recovery of tartaric acid from industrial enological wastes[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2001, 76(5): 485-488.

[4] 樓錦芳, 張建國. 酶法合成L(＋)-酒石酸的研究進展[J]. 食品科技,2006, 31(11): 162-164.

[5] NERANTZIS E T, TATARIDIS P. Integrated enology-utilization of winery by-products into high added value products[J]. Journal of Food Science and Technology, 2006(3): 1-12.

[6] SALGADO J M, RODRIGUEZ N, CORTES S, et al. Improving downstream processes to recover tartaric acid, tartrate and nutrients from vinasses and formulation of inexpensive fermentative broths for xylitol production[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2010, 90(13): 2168-2177.

[7] 楊文雄, 高彥祥. 響應(yīng)面法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 中國食品添加劑, 2005(2): 68-71.

[8] BRANDVIK P J, DALING P S. Optimization of oil spill dispersant composition by mixture design and response surface methods[J].Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 1998, 42(1/2): 63-72.

[9] 王振宇, 周芳, 趙鑫. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波提取大果沙棘總黃酮工藝[J]. 中國食品學(xué)報, 2007, 7(6): 44-51.

[10] 孟憲軍, 李冬男, 汪艷群, 等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化五味子多糖的提取工藝[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(4): 111-115.

[11] 龐玉珍, 齊風(fēng)蘭. 比色法測定葡萄酒中酒石酸的條件試驗[J]. 天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報, 1991, 11(1): 74-78.

[12] 張志清, 呂曉飛, 姚艷艷, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取麥麩中阿魏酸[J]. 中國糧油學(xué)報, 2010, 25(9): 76-81.

[13] 劉軍海, 黃寶旭, 蔣德超. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化艾葉多糖提取工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(2): 114-118.

[14] BOX G E P, BEHNKEN D W. Some new three level designs for the study quantitative variables[J]. Technometrics, 1960, 2(4): 455-475.

[15] RIVAS B, TORRADO A, MOLDES A B, et al. Tartaric acid recovery from distilled lees and use of the residual solid as an economic nutrient for Lactobacillus[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006,54(20): 7904-7911.

Optimization of Extraction Process for L(+)-Tartaric Acid from Vitis quinquangularis Lees via Response Surface Methodology

MI Si1，LI Hua2,*，LIU Jing2
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；
2. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

On the basis of one-factor-at-a-time experiments, Box-Behnken design (BBD) and response surface methodology(RSM) were applied to optimize extraction with 37% HCl and subsequent precipitation with CaCl2 involved in the extraction of L(+)-tartaric acid from Vitis quinquangularis lees. The optimal HCl treatment conditions were 82 ℃ of temperature, 7 min of treatment time and 18% (V/V) of lees-to-HCl. The optimal precipitation conditions were addition of CaCl2 at a ratio of 50 g/L for 2.4 h of precipitation at pH 6.64. Under these conditions, the L(+)-tartaric acid yield from Vitis quinquangularis lees was 41.63 g/L and the actual recovery rate of L(+)-tartaric acid was 87.64%.

Vitis quinquangularis；lees；L(+)-tartaric acid；response surface methodology；extraction

TS262.91

A

1002-6630(2012)08-0049-05

2011-03-29

米思(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：babymisi@126.com

*通信作者：李華(1959—)，男，教授，博士，研究方向為葡萄與葡萄酒學(xué)。E-mail：lihuawine@nwsuaf.edu.cn