雙酶法豬脂氧化改善天然豬肉香精風(fēng)味的應(yīng)用

孫 佳，王 超，曹雁平,2,*，王 蓓,2

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048；2.食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心，北京 100048)

雙酶法豬脂氧化改善天然豬肉香精風(fēng)味的應(yīng)用

孫 佳1，王 超1，曹雁平1,2,*，王 蓓1,2

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048；2.食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心，北京 100048)

研究雙酶法氧化豬脂在天然豬肉香精中的應(yīng)用。首先以過氧化值為評價指標(biāo)，單因素試驗和正交試驗確定的最佳酶解工藝條件為脂肪酶300μL、脂肪氧合酶400μL、pH8.88。感官評價表明，與使用空氣氧化豬脂和未使用氧化豬脂制備的豬肉香精相比，酶法氧化豬脂制備的豬肉香精香味飽滿，豬肉特征突出且脂香濃郁。用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法分析比較3種豬脂制備的豬肉香精的揮發(fā)性組成，結(jié)果表明，3種豬肉香精主體風(fēng)味成分一致，以2-乙酰呋喃、5-甲基-2-噻吩甲醛、3-甲基噻吩、2-戊基呋喃、2-硫代糠酯等風(fēng)味成分為主，并且酶氧化豬脂香精含較高比例的2-甲基-呋喃、5-甲基-2-噻吩甲醛。

脂肪酶；脂肪氧合酶；豬肉香精；氣相色譜-質(zhì)譜法

肉味香精是傳統(tǒng)食品現(xiàn)代化和餐飲連鎖化的重要基礎(chǔ)原料，其應(yīng)用涉及方便食品、肉制品、調(diào)味品、膨化食品、速凍食品、焙烤食品、菜肴等領(lǐng)域[1]。中國肉味香精生產(chǎn)始于20世紀(jì)80年代，經(jīng)過約30年的發(fā)展已經(jīng)形成獨立的產(chǎn)業(yè)。2009年全行業(yè)年銷售額約100億元人民幣，相關(guān)食品工業(yè)和餐飲業(yè)的產(chǎn)值超過1萬億元人民幣[2]。

脂肪氧化產(chǎn)物是肉類特征風(fēng)味的主要來源[3]。第三代肉味香精[4-6]使用的脂肪氧化產(chǎn)物通常采用空氣氧化方式制備，在實驗室規(guī)模的脂肪調(diào)控氧化反應(yīng)裝置是裝有機械攪拌和導(dǎo)氣管的四口燒瓶[2]；工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的設(shè)備是氣升式內(nèi)環(huán)流反應(yīng)器[7]?？諝庋趸娜秉c是反應(yīng)溫度高，能耗大。脂肪酶結(jié)合脂肪氧合酶氧化法制備氧化脂肪，即脂肪在脂肪酶作用下水解生成脂肪酸和甘油[8]，然后脂肪酸在脂肪氧合酶作用下氧化產(chǎn)生氫過氧化合物，氫過氧化合物通過均裂或β-裂變分解，形成了小分子的醇、醛、酮、酯等多種風(fēng)味物質(zhì)和熱反應(yīng)風(fēng)味前體物質(zhì)[9-12]，將其作為天然肉味香精的基料，用于制備各種類型的肉味香精。與空氣氧化方法相比，酶法氧化方法的原料利用率高、反應(yīng)條件溫和、工藝簡單、生產(chǎn)周期短、反應(yīng)易控制、能耗小，且不會造成環(huán)境污染[13-14]。本研究以豬脂為原料，研究豬脂酶法氧化產(chǎn)物對豬肉香精風(fēng)味的影響，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬脂 臺灣正義有限公司；豬里脊肉 市售；脂肪酶(2000U/mL)、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶 Novozymes公司；脂肪氧合酶(1×106U/0.4mL) 美國Sigma公司；KH2PO4、Na2HPO4、碘化鉀、可溶性淀粉、硫代硫酸鈉(均為分析純)、葡萄糖、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、VB1、木糖、L-半胱氨酸、水解植物蛋白(HVP) (均為食品級) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯甲烷、乙酸(均為分析純) 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠；恒溫水浴鍋 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；78-2磁力攪拌器國華電器有限公司；電磁空氣壓縮機 浙江森森實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶法豬脂氧化單因素試驗

固定豬脂8g、pH8.34的磷酸緩沖液2mL、溫度45℃、轉(zhuǎn)速110r/min。首先加入100μL脂肪酶，2h后加入脂肪氧合酶100μL，再反應(yīng)3h?；靹蚝蟛捎玫饬糠╗15]測其過氧化(peroxide value，PV)值。固定其他條件分別改變：脂肪酶量、脂肪氧合酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH值、轉(zhuǎn)速、反應(yīng)時間單一條件，考察其對PV值的影響。

1.3.2 正交試驗

選取脂肪酶量、脂肪氧合酶量和緩沖液pH值3個因素，設(shè)計L9(33)正交試驗優(yōu)化豬脂氧化條件，試驗設(shè)計見表1。

表1 雙酶法氧化豬脂正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal array design for optimization of dual-enzymatic oxidation of pork fat

1.3.3 空氣氧化豬脂的制備

準(zhǔn)確稱取8.00g豬脂，加入2mL 1/15mol/L pH8.34的 KH2PO4-Na2HPO4緩沖液，通入流速為0.16m3/h的壓縮空氣，在40℃條件下攪拌反應(yīng)7h。

1.3.4 熱反應(yīng)豬肉香精的制備

將100g 鮮豬里脊肉的肉糜和100g 去離子水加入到500mL燒杯中，95℃水浴保溫15min 后冷卻至48℃。加入0.6g復(fù)合蛋白酶處理0.5h，再加入1.2g 風(fēng)味蛋白酶處理1h，制成豬肉酶解物。

在裝有電動攪拌器、溫度計、回流冷凝管的100mL四口燒瓶中加入豬肉酶解物20g、葡萄糖1.2g、甘氨酸0.6g、丙氨酸0.6g、VB10.4g、木糖0.2g、谷氨酸0.3g、L-半胱氨酸1.2g、HVP 2g以及豬脂、空氣氧化豬脂或酶法氧化豬脂進(jìn)行熱反應(yīng)制備豬肉香精[16]，利用感官評價、揮發(fā)性成分分析研究不同類型豬脂對豬肉香精風(fēng)味的影響。

1.3.5 感官評價

將本研究中脂肪酶氧化法制備的豬肉香精(豬肉香精A)、空氣氧化法制備的豬肉香精(豬肉香精B)和未氧化豬脂制備的香精(豬肉香精C)按體積分?jǐn)?shù)5%用熱水稀釋品嘗。采用描述評分法進(jìn)行感官評價[17]，評價標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 豬肉香精感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation of pork essence

1.3.6 揮發(fā)性成分分析

1.3.6.1 固相微萃取

取3mL樣品裝入萃取玻璃瓶中，放入50℃恒溫水浴鍋中，平衡40min。平衡完成后用SPME針吸附40min。

1.3.6.2 GC-MS分析

色譜條件：DB-WAX色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)；載氣為氦氣，流速1.2mL/min；升溫程序：起始溫度40℃，以3℃/min 升溫至160℃，再以5℃/min升溫至240℃。

質(zhì)譜條件：70eV，電子電離(electron ionization，EI)，質(zhì)量掃描范圍30～450u，溶劑延遲4.00min。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶法豬脂氧化與優(yōu)化

2.1.1 脂肪酶量對豬脂氧化程度的影響

圖1 脂肪酶量對PV值的影響Fig.1 Effect of lipase amount on PV value

脂肪在脂肪酶和脂肪氧合酶的共同作用下會生成氫過氧化物，過氧化值是評價油脂氧化程度最基本的指標(biāo)[18-19]，本研究也采用PV值評價油脂氧化程度。由圖1可知，脂肪酶量為300μL時，氧化豬脂的PV值最高，故最佳脂肪酶量為300μL。

2.1.2 脂肪氧合酶量對豬脂氧化程度的影響

圖2 脂肪氧合酶量對PV值的影響Fig.2 Effect of lipoxygenase amount on PV value

由圖2可知，脂肪氧合酶量為400μL時，氧化豬脂的PV值最高，故最佳脂肪氧合酶量為400μL。

2.1.3 反應(yīng)溫度對豬脂氧化程度的影響

圖3 反應(yīng)溫度對PV值的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on PV value

由圖3可知，在35～40℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，豬脂的PV值增大；40～55℃范圍內(nèi)，溫度升高時豬脂的PV值逐漸減小，說明過高的溫度抑制了酶的活力。其中40℃時其PV值最高，因此反應(yīng)的最適溫度為40℃。

2.1.4 pH值對豬脂氧化程度的影響

圖4 pH值對PV值的影響Fig.4 Effect of pH on PV value

由圖4可知，在pH7.50～8.88的范圍內(nèi)，豬脂PV值先增大后減小，其中pH8.34時氧化產(chǎn)物PV值最大，故最佳pH值為8.34。

2.1.5 攪拌轉(zhuǎn)速對豬脂氧化程度的影響

圖5 攪拌轉(zhuǎn)速對PV值的影響Fig. 5 Effect of rotation speed on PV value

由圖5可見，轉(zhuǎn)速為110r/min時氧化產(chǎn)物的PV值最大，因此最適轉(zhuǎn)速為110r/min。

2.1.6 反應(yīng)時間對豬脂氧化程度的影響

圖6 反應(yīng)時間對PV值的影響Fig.6 Effect of reaction time on PV value

從圖6可以看出，PV值隨反應(yīng)時間的延長而增大，7h后趨于平緩，故7h為最佳反應(yīng)時間。

2.1.7 酶法豬脂氧化條件優(yōu)化

正交試驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。各因素對豬脂氧化狀態(tài)的影響趨勢見圖7。

表3 酶法豬脂氧化正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design and corresponding results for optimization of dual-enzymatic oxidation of pork fat

由表4極差R可以看出，在正交試驗所選擇的因素、水平范圍內(nèi)，脂肪氧合酶量是最重要的影響因素，脂肪酶量次之，pH值影響最小。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis for PV value with various reaction conditions

圖7 各因素對豬脂氧化狀態(tài)的影響趨勢Fig.7 Effects of three factors at three different levels on PV value

由圖7可以看出：脂肪酶量300μL、脂肪氧合酶量400μL、pH8.88時，PV值最高，而在其他水平上的PV值相對較小。因此，正交試驗獲得的豬脂氧化最優(yōu)組合為A2B2C3，即脂肪酶量300μL、脂肪氧合酶量400μL、pH8.88。

2.2 感官評價

評價員對3種豬肉香精各項指標(biāo)評分后統(tǒng)一求和，計算各香精樣品的分項得分和綜合得分。3種豬肉香精的分項感官描述得分見圖8。

圖8 3種豬肉香精各項指標(biāo)平均得分比較Fig.8 Comparison of average score for each index in three pork essences

由表5以及圖8可知，在各項指標(biāo)的感官評價中，本研究酶氧化法制備的豬肉香精(豬肉香精A)質(zhì)量最優(yōu)，而且各項指標(biāo)均處于較高水平，且脂香濃郁；空氣氧化法制備的豬肉香精(豬肉香精B) 次之，其脂香不夠突出，導(dǎo)致其特征香氣不夠飽滿；未氧化豬脂制備的香精(豬肉香精C)氣味最差，各項指標(biāo)得分均較低，尤其缺少氧化脂肪所產(chǎn)生的香氣，導(dǎo)致其整體香氣水平較低。

2.3 GC-MS分析

對酶氧化、空氣氧化和未氧化豬脂熱反應(yīng)制得的香精進(jìn)行GC-MS分析，得到總離子流色譜圖(圖9)，鑒定出的主要香味成分(相對含量＞0.4%)及其相對含量見表5～7。

圖9 豬肉香精的總離子流色譜圖Fig.9 Total ion current chromatograms of three pork essence

GC-MS分析結(jié)果顯示，3種豬肉香精含量較高的風(fēng)味物質(zhì)都為2-乙酰呋喃、5-甲基-2-噻吩甲醛、2-甲基呋喃、3-甲基噻吩、2-戊基呋喃、2-硫代糠酯等。其中，2-戊基呋喃是豬肉香精中對整體香味作出重要貢獻(xiàn)的關(guān)鍵芳香活性化合物[20-21]。

3種豬肉香精含量較高的風(fēng)味物質(zhì)都為2-乙酰呋喃、5-甲基-2-噻吩甲醛、2-甲基呋喃、3-甲基噻吩、2-戊基呋喃、2-硫代糠酯等。其中，呋喃類的含量最高，尤其是含有對豬肉風(fēng)味做出貢獻(xiàn)的關(guān)鍵芳香活性化合物2-戊基-呋喃[22-23]，因此3種香精都有濃郁的燉豬肉的香味。

酶法氧化豬脂制備的豬肉香精中，木糖為羰基化合物，HVP提供氨基化合物，高含量(25.6%)的乙酸提供了合適的pH值環(huán)境，因此酶法制備的香精中含有1,3-二嗪和二氫-2-甲基-3(2H)呋喃酮，使得酶法制備的豬肉香精在燉肉味的基礎(chǔ)上，還有烤香味[24]。與未氧化豬脂制備的豬肉香精對比，氧化豬脂的加入，對美拉德反應(yīng)產(chǎn)生了抑制作用，造成含硫化合物的含量降低，而酶法制備香精中含硫化合物的比例遠(yuǎn)少于空氣法制備的香精，這會導(dǎo)致熱反應(yīng)產(chǎn)物的刺鼻硫化物氣味變得柔和，出現(xiàn)協(xié)調(diào)的肉香味及豬肉的特征風(fēng)味[25]。其中，未氧化豬脂制備的豬肉香精中含有較高比例的3-甲基-噻吩、2-硫代糠酯，還含有空氣法和酶法沒有的吡嗪、2-乙酰吡咯和5-甲硫基四氮唑等；空氣氧化豬脂制備的豬肉香精含有較高比例的噻吩并[3,2-b]噻吩，含有其他方法沒有的1,2-苯并異噻唑和2-乙酰吡咯等，不含3-糠醛；酶氧化豬脂制備的豬肉香精中含有較高比例的2-甲基呋喃、5-甲基-2-噻吩甲醛，含有較多的3-糠醛[12]、2-丁酮、2-亞丙烯環(huán)丁烯、2-(3-羥丙基)-2-吡咯烷酮等。

表5 GC-MS分析未氧化豬脂制備的豬肉香精揮發(fā)性風(fēng)味成分Table 5 GC-MS analysis of flavor components in pork essence prepared with non-oxidized pork fat

表6 GC-MS分析空氣氧化豬脂制備的豬肉香精揮發(fā)性風(fēng)味成分Table 6 GC-MS analysis of flavor components in pork essence prepared with air-oxidized pork fat

表7 GC-MS分析酶氧化豬脂制備的豬肉香精揮發(fā)性風(fēng)味成分Table 7 GC-MS analysis of flavor components in pork essence prepared with enzymatically oxidized fat

3 結(jié) 論

實驗確定的酶法豬脂氧化最佳工藝條件為溫度40℃，反應(yīng)時間7h。正交試驗最佳組合為脂肪酶量為300μL、脂肪氧合酶量為400μL、pH8.88。感官評價表明，與空氣氧化法和未氧化法制備的香精相比，酶解脂肪豬肉香精香味飽滿，豬肉特征突出且脂香濃郁。GC-MS分析結(jié)果顯示，3種豬肉香精主體風(fēng)味成分一致，酶氧化豬脂香精含較高比例的2-甲基呋喃、5-甲基-2-噻吩甲醛等。

酶法氧化豬脂制備的天然肉味香精含有的較高的醛類使其豬肉特征風(fēng)味飽滿，但是含有2-戊基呋喃的比例較低，其燉肉味相比未氧化法和空氣法制備的香精較淡。因此，有必要進(jìn)一步研究確定其他成分對天然豬肉香精風(fēng)味的影響，以及氧化豬脂中各成分形成天然豬肉香精風(fēng)味成分的機制和途徑。

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Application of Pork Fat Oxidized by Dual Enzyme Method for Improving the Flavor of Natural Pork Essence

SUN Jia1，WANG Chao1，CAO Yan-ping1,2,*，WANG Bei1,2
(1. College of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing 100048, China)

The application of pork fat oxidized by dual enzyme method for improving the flavor of natural pork essence was explored in this work. The optimal enzymatic reaction conditions for preparing oxidized pork fat, as determined using onefactor-at-a-time and orthogonal array design methods based on peroxide value (PV), were 300 μL of lipase, 400 μL of lipoxygenase and pH 8.88. Sensory evaluation revealed that pork essence based on oxidized pork fat obtained from enzymatic oxidation had a full aroma and outstanding characteristic flavor of porcine fat as compared with pork essences prepared from air-oxidized or non-oxidized pork fat. The results of solid phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry (SPME/ GC-MS) analysis indicated that these three pork essences had the same major flavor components, which included 1-(2-furanyl)-ethanone, 5-methyl-2-thiophenecarboxaldehyde, 3-methyl-thiophene, 2-pentyl-furan and 2-furfurylthiol. Moreover, pork essence based on enzymatically oxidized fat was richer in 2-methyl-furan and 5-methyl-2-thiophene formaldehyde.

lipase；lipoxygenase；pork flavor；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS264.3

A

1002-6630(2012)16-0084-07

2012-04-02

孫佳(1988—)，女，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)。E-mail：jiaer0620@163.com

*通信作者：曹雁平(1961—)，男，教授，博士，研究方向為食品化學(xué)與安全。E-mail：caoyp@th.btbu.edu.cn