菜園根際土壤解磷真菌的分離篩選及初步鑒定

肖春玲，宋勇生，王安萍，溫艷梅，汪文麗

菜園根際土壤解磷真菌的分離篩選及初步鑒定

*肖春玲1,2，宋勇生1,2，王安萍1,2，溫艷梅1，汪文麗1

（1.井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西，吉安343009；2. 江西省生物多樣性與生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西，吉安343009）

為提高土壤磷利用率及微生物修復(fù)污染環(huán)境提供參考依據(jù)，本研究采用平板涂布法，從不同蔬菜根際土壤中分離得到11株降解有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷的解磷真菌。根據(jù)透明圈直徑和菌落直徑比值的大小, 從中篩選到3株分解無(wú)機(jī)磷較強(qiáng)的菌株WP-2、WP-5、WP-7；并進(jìn)一步通過(guò)液體搖瓶培養(yǎng)復(fù)篩，確定其中的WP-5菌株分解無(wú)機(jī)磷能力最強(qiáng)，其解磷能力達(dá)66.88 mg/L。經(jīng)初步鑒定，WP-2菌株屬于木霉屬（）、WP-5菌株屬于青霉屬（）、WP-7菌株屬于小克銀漢霉屬。

解磷真菌；分離鑒定；根際土壤；解磷能力

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的三大營(yíng)養(yǎng)元素之一，但土壤中95％~99％的磷為無(wú)效磷形式，植物很難直接吸收利用，嚴(yán)重影響著植物生長(zhǎng)特別是農(nóng)作物產(chǎn)量[1-2]。我國(guó)有74%的耕地土壤缺乏有效磷，磷成為這些耕地中限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素之一[3]。長(zhǎng)期以來(lái)，人們通過(guò)施入磷肥來(lái)滿足作物生長(zhǎng)的需要，但磷肥的當(dāng)季利用率僅為5%~25%，大部分磷與土壤中的Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+結(jié)合形成難溶性磷酸鹽, 造成了作物的低吸收和磷元素在土壤中的大量積累，降低了磷肥的利用率并帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境污染[4-5]。近年來(lái)，利用植物根際與磷循環(huán)相關(guān)的生物學(xué)系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)植物根際磷的有效性，特別是利用解磷微生物來(lái)活化土壤難溶性磷，已成為提高土壤磷的有效性研究熱點(diǎn)[6]。土壤中具有解磷作用的微生物包括細(xì)菌、真菌和放線菌等，其中解磷真菌的溶磷能力較強(qiáng)，而且遺傳性狀相對(duì)穩(wěn)定。解磷微生物有強(qiáng)烈的根際效應(yīng)，在植物根際的數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其周圍土壤中的數(shù)量，從特定作物的根際土壤中篩選高效解磷菌, 可以獲得與作物親和性好、易于在根際定植的菌株，從而更有利于其解磷能力的發(fā)揮[7]。本研究以菜園根際土壤為材料，利用選擇培養(yǎng)基篩選高效解磷真菌，探究不同碳源和氮源對(duì)解磷真菌溶磷的影響，以期為提高土壤磷利用率及微生物修復(fù)污染環(huán)境提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試根際土壤

從井岡山大學(xué)校園周邊的菜地中, 采用5點(diǎn)取樣法，采集白菜、油菜、大蒜、香菜、大豆和豌豆的小根及黏附其上的根際土壤，混合后分別裝入無(wú)菌袋中備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g, (NH4)2SO40.5 g, MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·7H2O 0.03 g，Ca3(PO4)25 g, 水1000 mL，pH = 6.0~6.5。

有機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10g, (NH4)2SO40.5 g, MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g, MnSO4·7H2O 0.03 g, CaCO35 g，蛋黃液10 mL（蛋黃液為無(wú)菌生理鹽水與雞蛋黃1∶1配制）, 水1000 mL，pH = 6.0~6.5

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，水1000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤懸液的制備

無(wú)菌條件下取不同蔬菜小根及黏附其上的根際土壤稱量后，溶于裝有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，28 ℃恒溫振蕩30 min，使微生物細(xì)胞充分分散，然后取出蔬菜小根，瀝干水分，稱其重量，計(jì)算三角瓶中土壤懸液的濃度，然后進(jìn)行倍比稀釋至10-6。

1.2.2 菌株分離

將梯度稀釋后的土壤懸液各取 0.2 mL 涂布于分離培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度重復(fù) 3 皿，28 ℃恒溫培養(yǎng) 3~7 d，挑取生長(zhǎng)旺盛、具有較大透明圈的單菌落轉(zhuǎn)至PDA培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)成熟后放4 ℃冰箱保藏。

1.2.3 解磷菌的篩選

將分離的單菌株分別在PDA培養(yǎng)基上活化，然后采用透明圈法進(jìn)行初篩。復(fù)篩時(shí)挑選初篩中透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）較高的菌株分別在PDA培養(yǎng)基斜面上活化后轉(zhuǎn)接1次，置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6 d，再用無(wú)菌水制成108個(gè)/mL孢子懸浮液，按1%的接種量接入無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，以接等量的無(wú)菌水作對(duì)照，每株3 次重復(fù)，160 r/min，28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)6 d，每天取培養(yǎng)液離心后，用鉬銻抗比色法測(cè)定上清液中可溶性磷的含量[8-9]。

1.2.4可溶性磷的測(cè)定方法

首先繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確吸取5 mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL分別于50 mL容量瓶中，然后各加入2mL鉬銻抗顯色劑，蒸餾水定容至20 mL，即得含磷量分別為0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mg/L的磷標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。在室溫20 ℃以上的條件下?lián)u勻靜置30 min后，在700 nm 波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。以磷濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)得磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:= 0.2861x+0.0068，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9994，線性關(guān)系良好。然后將斜面保存的菌種活化后制取孢子懸液，按1%的接種量接入無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，以接等量的無(wú)菌水作對(duì)照，每株做3次重復(fù)，160 r/min，28℃搖床振蕩培養(yǎng). 每天取培養(yǎng)液離心后，用鉬銻抗比色法測(cè)定上清液中可溶性磷的含量。

1.2.5 無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基的優(yōu)化

將供試菌株活化后制成孢子懸液，按1%的接種量接于不同的無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基上，碳源分別為葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉；氮源分別為硫酸銨、氯化銨、尿素和酵母浸膏，液體培養(yǎng)基其它成分和濃度保持不變，每株3次重復(fù)，160 r/min，28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)6 d，每天取培養(yǎng)液離心，用鉬銻抗比色法測(cè)定上清液中可溶性磷含量。

1.2.6 解磷菌的鑒定

解磷菌的形態(tài)觀察及分類鑒定參照李振高、魏景超和邢來(lái)君等[10-12]的方法進(jìn)行。分別挑取待測(cè)菌株的孢子點(diǎn)植于PDA培養(yǎng)基平板上（每板3個(gè)點(diǎn)），28 ℃恒溫培養(yǎng)3~10 d，每天觀察菌落特征和個(gè)體形態(tài)的變化，根據(jù)菌株的形態(tài)特征進(jìn)行檢索和初步鑒定。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，采用Excel2003作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與初篩

從白菜等6種蔬菜的根際土壤中共分離到11株解磷真菌，其中解無(wú)機(jī)磷菌株7株，解有機(jī)磷菌株4株。透明圈法測(cè)定結(jié)果（表1）顯示，WP-2、WP-5和WP-7菌株分解無(wú)機(jī)磷的能力較強(qiáng)，其透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）分別為1.92、2.41和1.96，其中WP-5的解磷能力最強(qiáng)。

表1　透明圈法測(cè)定解磷真菌的解磷能力

2.2 復(fù)篩結(jié)果分析

圖1　培養(yǎng)液中溶磷量隨時(shí)間的變化

三株解磷真菌培養(yǎng)液中溶磷量隨時(shí)間的變化結(jié)果（圖1）顯示：三株解磷真菌均在搖瓶培養(yǎng)5 h后溶磷量達(dá)到高峰，其中WP-5菌株的解磷能力最強(qiáng)，搖瓶培養(yǎng)5 d后溶磷量高達(dá)66.88 mg/L；WP-2次之，搖瓶培養(yǎng)5 d后溶磷量達(dá)到59.75 mg/L；而WP-7初篩時(shí)D/d值大于WP-2，但復(fù)篩時(shí)解磷能力小于WP-2，搖瓶培養(yǎng)5 d后溶磷量最高僅為42.69 mg/L，這表明菌株在固體和液體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和代謝存在差異，解磷能力并非完全一致。

2.3 解磷真菌的初步鑒定

根據(jù)菌株的形態(tài)特征（表2）檢索, 初步鑒定WP-2菌株屬于木霉屬（），WP-5菌株屬于青霉屬（），WP-7菌株屬于小克銀漢霉屬。

表2 菌株的形態(tài)特征及初步鑒定結(jié)果

2.4 碳源對(duì)解磷能力的影響

圖2　不同碳源對(duì)WP-5 解磷能力的影響

圖2表明，提高解磷能力的最佳碳源是蔗糖。當(dāng)碳源使用蔗糖時(shí)，搖瓶培養(yǎng)5 d后WP-5菌株的溶磷活性最高，溶磷量高達(dá)69.81 mg/L。其次為葡萄糖，搖瓶培養(yǎng)5 d后溶磷量也達(dá)到 66.57 mg/L。

2.5 氮源對(duì)解磷能力的影響

圖3　不同氮源對(duì)WP-5解磷能力的影響

圖3顯示，氮源為硫酸銨時(shí)，搖瓶培養(yǎng)5 d后WP-5菌株的溶磷量最高，達(dá)到66.73 mg/L；其次是尿素和酵母浸膏，而用氯化銨作為氮源時(shí)，溶磷量明顯下降。

3 討論

本研究采用透明圈法進(jìn)行初篩，在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基平板上, 28℃培養(yǎng)6 d 后，WP-2、WP-5和WP-7菌株的透明圈直徑與菌落直徑的比值(D/d)均超過(guò)了1.90，但比較表1和圖1可知，復(fù)篩時(shí)測(cè)定的可溶性磷含量和D/d 值二者之間并不存在線性關(guān)系，D/d 值為1.92的WP-2菌株，在搖瓶復(fù)篩中溶磷量最高達(dá)59.75 mg/L；而WP-7菌株的D/d值（1.96）大于WP-2，但搖瓶復(fù)篩中溶磷量最高僅為42.69 mg/L，解磷能力明顯小于WP-2。這可能與解磷菌在固體和液體不同環(huán)境的培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的酶、有機(jī)酸的數(shù)量和種類以及菌落在平板上堆積情況的差異等有關(guān)；同時(shí)也表明在解磷菌的篩選中，透明圈法只能定性地反映菌株的解磷能力,而要定量評(píng)價(jià)菌株的解磷能力，液體的搖瓶復(fù)篩是很重要的一個(gè)步驟[13-15]。

解磷微生物的解磷能力，主要受菌體自身特性的影響，也與培養(yǎng)基中碳源、氮源等培養(yǎng)條件有關(guān)[16-17]。本研究結(jié)果表明，不同的碳源和氮源對(duì)解磷真菌的解磷能力影響較大，以蔗糖為碳源時(shí)，WP-5菌株的解磷能力最強(qiáng)，說(shuō)明蔗糖是其最佳碳源之一，但WP-5菌株對(duì)可溶性淀粉的利用最低。同時(shí)，WP-5菌株的溶磷能力受氮源影響也很明顯，在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中，其解磷活性較高，而用氯化銨作為氮源時(shí)，溶磷量明顯下降。

本研究中, 我們初步建立了根際土壤解磷真菌的篩選體系, 并對(duì)產(chǎn)生較大解磷圈的菌株WP-5在固體和液體條件下的解磷能力進(jìn)行了測(cè)定,同時(shí)優(yōu)化了無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基。結(jié)果顯示, 該菌株有較強(qiáng)的解磷能力, 對(duì)于該菌株在不同土壤、不同作物、不同環(huán)境下的生長(zhǎng)繁殖特點(diǎn)以及與根瘤菌、菌根菌、纖維素分解菌等組合解磷還有待于進(jìn)一步的研究。

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ISOLATION AND SCREENING OF PHOSPHATE-SOLUBILIZING FUNGI FROM THE RHIZOSPHERIC SOIL AND ITS PRILIMINARY IDENTIFICATION

*XIAO Chun-ling1,2, SONG Yong-sheng1,2, WANG An-ping1,2, WEN Yan-mei1, WANG Wen-li1

（1.School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China; 2. Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering of Jiangxi Province, Ji’an, Jiangxi 343009, China）

In order to improve the utilization ratio of soil phosphorus and provide the reference for microbial remediation pollution environment, eleven strains of organic and inorganic phosphate-solubilizing fungi were isolated from different vegetables rhizospheric soil by spread plate method. Three fungi strains WP-2, WP-5 and WP-7 with higher inorganic phosphate-solubilizing ability were obtained according the ratio of hyaline circle diameter and colony diameter, and then the strain WP-5 with the highest inorganic phosphate-solubilizing ability was screened out by shake culture experiment, its ophosphate-degradation ability reached to 66.88mg/L.Three strains were selected and identified assp.,sp. andsp.

phosphate-solubilizing fungi; isolation and identification; rhizospheric soil; phosphate-solubilizing ability

S154.38+1

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2012.04.011

1674-8085(2012)04-0048-04

2012-03-24；

2012-05-27

江西省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(GJJ10690)；江西省生物學(xué)高水平學(xué)科資助項(xiàng)目

*肖春玲(1962-)，女，江西吉安人，教授，主要從事微生物學(xué)教學(xué)和研究(E-mail: xiaochunling@jgsu.edu.cn);

宋勇生(1977-)，男，江西吉水人，講師，博士，主要從事環(huán)境生物學(xué)教學(xué)和研究(E-mail: yshson001@126.com);

王安萍(1971-)，女，江西吉安人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)和研究(E-mail: jskwangap@hotmail.com);

溫艷梅(1989-)，女，江西永豐人，井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生(E-mail: hanxin008@126.com);

汪文麗(1989-)，女，江西上饒人，井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生(E-mail: wwl07@126.com).