PCR法定性檢測大豆食用油中轉(zhuǎn)基因成分

周紅霞，華 春，張紅琳，李俊芳，祝長青，黃 明，周光宏，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210095; 2.南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇南京211171; 3.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇南京 210001）

PCR法定性檢測大豆食用油中轉(zhuǎn)基因成分

周紅霞1，2，華 春2，張紅琳2，李俊芳2，祝長青3，黃 明1，周光宏1，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210095; 2.南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇南京211171; 3.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇南京 210001）

針對大豆食用油中核酸含量低且被嚴(yán)重破壞、DNA難以提取的問題，對CTAB法進行優(yōu)化，有效從食用油中提取到可用于PCR擴增反應(yīng)的DNA模板。同時定性檢測出大豆內(nèi)源基因lectin，外源調(diào)控序列啟動子CaMV35S、終止子Nos及目的基因CP4－EPSPS序列，成功建立了基于PCR技術(shù)在大豆食用油中快速檢測轉(zhuǎn)基因成分的方法。

大豆食用油，轉(zhuǎn)基因檢測，DNA提取，PCR

由于轉(zhuǎn)基因生物（GMO）具有抗逆性，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本相對較低，具有較好的市場競爭性和應(yīng)用前景，故隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展，加速了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的市場化、商品化，使其具有較好的市場競爭性及應(yīng)用前景［1］。但轉(zhuǎn)基因生物的廣泛應(yīng)用是否會對生態(tài)環(huán)境和人類生物的健康造成不良影響，至今仍無定論［1］。據(jù)此，歐盟、日本等國家先后制定了轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識管理政策，以保護消費者的知情權(quán)和選擇權(quán)。我國也要求從2002年3月20日起標(biāo)識市售轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、油菜、番茄、棉花及其加工產(chǎn)品［2］。PCR的技術(shù)手段由于其高效性而成為轉(zhuǎn)基因食品的最常用檢測方法［3－7］。國際通用方法是以PCR技術(shù)為平臺，通過特異擴增轉(zhuǎn)基因調(diào)控原件花椰菜花葉病毒（CaMV35S）啟動子、胭脂堿合酶（NOS）終止子以及目的基因抗除草劑基因CP4－EPSPS來篩選檢測轉(zhuǎn)基因食品［3－7］。食用油作為一種精深加工食品，經(jīng)過240℃高溫和高壓等加工步驟之后，核酸嚴(yán)重破壞，且含量低，提取困難，成為限制檢測其中轉(zhuǎn)基因成分的瓶頸［8－19］。另外食用油的主要成分是脂類物質(zhì)，水溶性的DNA含量相當(dāng)少，因此精煉油中DNA的提取重點是如何有效富集其中的微量DNA。國內(nèi)外有食用大豆油轉(zhuǎn)基因檢測的報道，但多采用試劑盒的方法［8－18］，欒鳳俠［12］比較了CTAB法和W izard試劑盒法提取精煉大豆油DNA的效果，結(jié)果表明試劑盒法提取效果優(yōu)于CTAB法。程紅梅［15］采用了離心柱法從10m L大豆油中提取到0.4μg的DNA，白立群［17］采用冷凍干燥法從20m L食用油中提取到可用于檢測的DNA。Paul［20］和Zhang［21］，分別采用W izard試劑盒法及W izard Magnetic DNA Purification System for Food Kit（Promega）試劑盒提取大豆油中DNA，均認(rèn)為大豆精煉油中不能提取出DNA，因此如何高效提取精煉油中的DNA始終是轉(zhuǎn)基因檢測的瓶頸難點。盡管油脂中轉(zhuǎn)基因成分的檢測已有相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)出臺，但作者通過多次實驗發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)中介紹的方法并不能完全有效地提取油脂中DNA。我們參照前人介紹的方法［11－18］，對其中的某些步驟進行了改進，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改進的方法較之于標(biāo)準(zhǔn)方法，其DNA提取的有效性大大提高，所提取的DNA完全能夠用于后續(xù)的PCR檢測，并通過PCR擴增CaMV35S啟動子、NOS終止子以及抗除草劑基因CP4－EPSPS來定性檢測轉(zhuǎn)基因食用油，為大豆深加工食品的轉(zhuǎn)基因檢測提供切實可行的基礎(chǔ)。

表1 檢測不同基因所用引物及產(chǎn)物大小Table 1 List of different specific primer and the size of their product

表2 PCR反應(yīng)條件Table 2 PCR reaction conditions

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福臨門一級大豆食用油、豆維家大豆食用油、金龍魚大豆食用油 均從超市購得;轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因大豆 江蘇出入境檢驗檢疫局惠贈;CTAB、Tris、SDS、Taq酶、核酸共沉淀劑（DNAmate）、引物上海生工。

凝膠成像儀GelDoc 2000 system 美國BioRad公 司;Mastercyclerep personal PCR 儀 德 國Enpendorf公司;水平電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司;Ultraturrax T25高速勻漿器 德國 IKAWERKE公司。

1.2 引物

大豆食用油中Lectin內(nèi)源基因、CaMV35S啟動子基因、NOS終止子基因、CP4－EPSPS外源基因的引物序列見表1［19］。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆食用油中DNA的提取 參照前人方法［11－18］，取1m L食用油到2m L離心管中，加入400μL的TE緩沖液，顛倒搖勻5m in，常溫13000 r/min離心3min，去除上層油脂層，在同一只離心管中再加入1m L的食用油，顛倒搖勻5m in，常溫13000 r/m in離心3m in，去除上層油脂層，以上步驟重復(fù)15～20次。取水相轉(zhuǎn)移至新的 2m L離心管中，在水相中加400μL的CTAB提取液和2μL的RNA酶，渦旋震蕩1～3s，65℃水浴30m in后加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（24∶1），輕緩顛倒數(shù)次后靜置 5m in，常溫13000 r/min離心3m in，轉(zhuǎn)移上清液置于另一個2m L的離心管中。加入上清液 1/10體積的3mmol/L NaAc（pH 5.2）溶液，均勻混合，再加入4μL的DNA共沉淀劑溶液，均勻混合。轉(zhuǎn)移離心管中一半的溶液于另一個新的2m L離心管中，分別加入2.5倍體積的－20℃預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻，12000 r/m in 4℃條件下離心20min，棄溶液，留白色沉淀。加入－20℃預(yù)冷的70%乙醇1m L，洗滌沉淀兩次。12000 r/m in 4℃條件下離心5m in后小心棄去乙醇，自然干燥。每個離心管中加30μL 0.1×TE緩沖液溶解沉淀，4℃保存?zhèn)溆?。以去離子水作空白對照。

1.3.2 PCR檢測大豆食用油DNA的轉(zhuǎn)基因成分

1.3.2.1 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 反應(yīng)體系:10× PCR Buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl22.5μL，dNTP 2.5mmol/L 2.0μL，20pmol/μL引物（正:0.25μL，反: 0.25μL），5U/μL Taq酶0.125μL，DNA模板通常取量為2～5.0μL，所補超純水量隨DNA模板量而變化，最終補足25μL。PCR反應(yīng)條件見表2，同時設(shè)陽性對照、陰性對照、空白對照。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物 取5μL PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，緩沖液為用1×TAE電泳緩沖液，在5V/cm電壓中電泳20m in，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取

將提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果沒有條帶出現(xiàn)（結(jié)果未顯示），分析原因是由于食用油脂中DNA含量非常低，以致常規(guī)的凝膠電泳無法顯示。因為提取過程加入核酸共沉淀劑，因此提取后的目標(biāo)DNA含量及純度無法用紫外分光光度法確定，紫外所獲取的OD值，都可能是核酸共沉淀劑和目標(biāo)DNA的混合信息。

2.2 大豆內(nèi)源基因Lectin的檢測

Lectin基因是大豆所特有的內(nèi)源性基因，任何以大豆為原料制備的產(chǎn)品均應(yīng)含有該基因。檢測內(nèi)源基因可以判斷從食用油中是否成功提取到DNA，以及所提取的DNA是否適合于PCR擴增，同時還可以判斷所提取的DNA是否含有PCR擴增抑制物，從而避免結(jié)果出現(xiàn)假陰性。按表2的PCR條件首先檢測了Lectin基因，以水代替DNA模板為空白對照，以非轉(zhuǎn)基因大豆為陰性對照，以轉(zhuǎn)基因大豆為陽性對照，以提取過程中添加的DNA共沉淀劑代替DNA模板作為對照，排除其引物模板的可能性。圖1顯示了大豆內(nèi)源基因Lectin的檢測結(jié)果，三種油、轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因大豆均能擴增出約118bp左右的片段，說明所提取的DNA質(zhì)量較好，可用作PCR檢測模板。DNA共沉淀劑在PCR檢測中無新條帶出現(xiàn)，說明其增加了提取效率但并沒有引入外源基因，可以作為安全的DNA共沉淀劑。第六泳道陽性對照擴增的條帶亮度低于三種大豆食用油的主要原因為陽性對照DNA和食用油中DNA提取時間不一致，陽性對照大量提取一次，存放備用，可能存放的時間比較久。

圖1 PCR檢測大豆油內(nèi)源基因LectinFig.1 PCR amplification results of endogenous Lectin in DNA sample of soybean oil

2.3 大豆食用油中外源基因的檢測

外源基因的檢測通常包括兩方面:一是調(diào)控基因的檢測，另一個是目的基因的檢測。首先我們對調(diào)控基因CaMV35S啟動子和NOS終止子按表2的PCR條件進行擴增檢測，結(jié)果見圖2和圖3。由此可以看出轉(zhuǎn)基因大豆和三個品種的大豆食用油均能擴增出約195bp的CaMV35S啟動子（圖2）和約180bp的NOS終止子片段（圖3）。

圖2 大豆食用油CaMV35S啟動子的PCR檢測Fig.2 PCR amplification results of CaMV35S promoter in DNA sample of soybean oil

圖3 大豆食用油NOS終止子的PCR檢測Fig.3 PCR amplification results of NOS terminator in DNA sample of soybean oil

由于CaMV35S啟動子來源于花椰菜花葉病毒，NOS終止子來源于根癌農(nóng)桿菌，因此若原料大豆被花椰菜花葉病毒或被根癌農(nóng)桿菌侵染，就會有假陽性出現(xiàn)。因此除了檢測調(diào)控基因還要檢測目的基因CP4－EPSPS才能下最終結(jié)論。

利用改進方法提取的三個品種大豆食用油中的DNA，用CP4－EPSPS引物按表2的PCR條件進行擴增，以水代替DNA模板為空白對照，以非轉(zhuǎn)基因大豆為陰性對照，以轉(zhuǎn)基因大豆為陽性對照，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，所提取的DNA可以成功檢測到目的基因CP4－EPSPS320bp片段，且擴增出的片段與轉(zhuǎn)基因大豆一致，而非轉(zhuǎn)基因大豆和水空白對照均未檢測出該片段。據(jù)國內(nèi)檢測機構(gòu)反映，通常在精煉食用油中能檢測到35S啟動子和NOS終止子，但是檢測不到CP4－EPSPS目的基因，因此，本研究所建立的大豆食用油DNA提取方法簡單方便，可用于大豆深加工DNA提取的檢測。

3 討論

精煉油中DNA提取的重點是如何有效地富集大豆油中微量DNA，本文在前人基礎(chǔ)上分別對DNA提取和PCR檢測作了如下改進，取得了滿意的檢測效果。

a.提取樣品的初始量是能否成功提取DNA的關(guān)鍵因素。文獻［9－11］中報道的1～5m L的樣品量難以提取到可供PCR檢測的DNA量，當(dāng)樣品量增加到20m L時，可成功檢測到（見圖1～圖3）。

圖4 大豆油目的基因CP4－EPSPS的PCR檢測Fig.4 PCR amplification results of CP4－EPSPS in DNA smample of soybean oil

b.提取開始前利用DNA可溶于水溶液的特性，在食用油脂中加入一定體積的TE溶液進行洗滌以萃取其中含量極少的DNA;另外顛倒搖勻時切忌劇烈震蕩，否則會破壞DNA。

c.為了提高食用油中DNA的沉淀效果可加入核酸共沉淀劑，共沉淀劑最好選擇與目標(biāo)DNA相差較遠的物種，以本研究所用的核酸共沉淀劑作為PCR反應(yīng)的陰性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不干擾待測目標(biāo)片段的檢出（見圖1第6泳道）。

d.沉淀DNA的步驟中加入NaAc，NaAc提供弱酸環(huán)境，可促使DNA沉淀。

e.本文研究中發(fā)現(xiàn)，為了提高CP4－EPSPS基因檢出成功率，目的片段的穩(wěn)定性比長短更重要。本文曾經(jīng)選擇170bp大小的目的片段，但沒有檢測到（結(jié)果未顯示），最后選擇富含GC堿基對的823－1143序列作為檢測目的片段，PCR最終獲得成功（見圖4），分析可能的原因是，這段序列富含GC，在加工中穩(wěn)定性好，不容易被破壞，所以雖然目的片段變長，但依然可以成功檢測到。這一發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用于其他深加工轉(zhuǎn)基因食品的檢測中。

本研究成功建立了基于PCR技術(shù)在大豆食用油中快速檢測轉(zhuǎn)基因成分的方法。該方法所檢測的CaMV35S啟動子、NOS終止子、CP4－EPSPS等基本覆蓋了世界上已商品化的轉(zhuǎn)基因大豆及其深加工產(chǎn)品，因此所建立的檢測體系具有通用性，該方法利用大豆內(nèi)源基因Lectin作為內(nèi)參照，可以直接檢測提取的DNA質(zhì)量，同時設(shè)立了陽性質(zhì)控、陰性質(zhì)控和空白對照，從而避免了假陰性、假陽性以及污染可能造成的假性結(jié)果，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性，基本滿足各國及地區(qū)定性檢測，在篩選過程中若為陰性的樣品，可直接判斷為陰性，若為陽性，可進一步做鑒定檢測。

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Detection of genetically modified com ponents in soybean oil by PCR

ZHOU Hong－xia1，2，HUA Chun2，ZHANG Hong－lin2，LI Jun－fang2，ZHU Chang－qing3，HUANG M ing1，ZHOU Guang－h(huán)ong1，*
（1.National Center of Meat Quality and Safety Control，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China; 2.School of Biochemical and Environmental Engineering，Nanjing Xiaozhuang University，Nanjing 211171，China; 3.Nanjing Entry－exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，China）

A qualitative m ethod for detecting of transgenic genes in ed ib le oils was reported.It was norm ally considered that ed ib le oils，especially refining oils，w ith low content DNA，RNA and p roteins.A usefulmethod for extrac tion DNA from the ed ib le oilsam p les was estab lished，it could be used as tem p late for PCR.The endogenous genes（Lec tin）and transgenic genes（CaMV35S，Nos，CP4－EPSPS）were detec ted in the ed ib le oil sam p les by the PCRmehtod.

soybean oils;detection GMO;DNA extrac tion;PCR

TS207.3

A

1002－0306（2012）06－0087－05

2011－04－26 *通訊聯(lián)系人

周紅霞（1976－），女，副教授，博士后，研究方向:食品生物技術(shù)。

農(nóng)業(yè)部《轉(zhuǎn)基因重大專項》（2009ZX08012－014B）;江蘇省教育廳高校自然科學(xué)與研究項目（10KJD550005）。