超聲波輔助提取蘋果皮中總黃酮工藝條件的優(yōu)化

焦 巖，常 影

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾 161006）

超聲波輔助提取蘋果皮中總黃酮工藝條件的優(yōu)化

焦 巖1，2，常 影1，*

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾 161006）

采用超聲波輔助法對蘋果皮中的總黃酮進行提取和條件優(yōu)化。在單因素實驗的基礎上，用響應面研究了乙醇體積分數、液固比、提取時間對黃酮得率的影響。并由此確定了超聲波輔助提取蘋果皮中總黃酮最佳提取工藝條件：乙醇體積分數50.3%、液固比28.9∶1、時間49.1min，黃酮得率為19.32mg/g。

蘋果皮，黃酮，超聲波提取，響應面法，工藝條件

黃酮化合物是廣泛存在于水果和蔬菜中的一類次生代謝物質，近來研究發(fā)現，黃酮類物質對心腦血管疾病、新陳代謝及免疫系統有重要作用，對缺血性腦血管疾病有很好的防治及緩解作用[1-2]。此外，黃酮能夠有效地預防和治療癌癥、骨質疏松、婦女更年期綜合征等多種疾病，黃酮在保健食品和醫(yī)藥領域有著廣闊的應用前景[3-5]。黃酮是蘋果果實中的主要多酚類物質，是蘋果中的重要抗氧化物質來源。蘋果果實中含有豐富的黃酮類物質，且主要集中在果皮部分，果皮中的黃酮含量遠高于果肉和果心[6-7]。近年來，國內外研究者對蘋果果實中的黃酮研究較多，而由于蘋果皮中含有較多營養(yǎng)和功能成分，因此對蘋果皮中黃酮類物質的提取和功能研究也成為當今國內外研究的熱點[8-11]。例如美國康奈爾大學的研究者正在研究蘋果皮中的多酚和黃酮類物質的結構和抗癌功能，并研究其提取物作為功能食品添加劑等。超聲波輔助提取法因具有提取時間短、效率高、提取液中雜質少、對有效成分結構破壞較小、提取溫度可控等優(yōu)點在天然植物活性成分的提取有較多應用[12-13]。為了充分利用蘋果加工副產物，有效利用蘋果皮中的活性黃酮類物質，首先在比較了四種市售蘋果皮中的黃酮含量基礎上，篩選了黃酮含量比較高的蘋果皮種類，采用單因素實驗和響應面法，得到了超聲波輔助提取蘋果皮中總黃酮的最佳工藝條件，為蘋果資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮富士蘋果、花牛蘋果、國光蘋果、黃元帥蘋果 市售，清洗后取皮，將蘋果皮真空干燥箱低溫干躁，粉碎至60目，于-20℃凍藏備用；蘆丁標準品 美國Sigma公司；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等試劑 上?；瘜W試劑公司，分析純。

DHG-9240A型電熱真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；JA2003電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；DK-98-1型電熱水浴鍋，FW 100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；UV-2450型紫外—可見分光光度計 日本島津；PB-10型pH計 德國Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘋果皮黃酮提取工藝流程 干燥恒重的蘋果皮→粉碎→過60目篩→超聲波輔助提取→測定黃酮得率

1.2.2 黃酮含量的測定 標準方程的建立：蘋果皮黃酮按NaNO2-Al（NO3）3比色法顯色法測定[14]（40%乙醇作溶劑），以蘆丁為標準對照品，用紫外可見分光光度計在510nm處比色，測定不同濃度蘆丁標準品溶液吸光度，繪制標準曲線，得到標準方程：A=0.0015x+ 0.0002（R2=0.9987），式中：A為吸光度；x為蘆丁含量，mg/m L。

樣品中黃酮含量的測定：取各組不同實驗條件下所得的定容樣液依法顯色，按下式計算蘋果皮黃酮得率y（以蘆丁計），y=（A-0.0002）V/（0.0015m），式中：y為黃酮得率，mg/g；A為樣液的吸光度；m為各組實驗樣品質量，g；V為總體積數，m L。

1.2.3 不同種類蘋果皮中黃酮含量的比較 分別取干燥后的富士蘋果、花牛蘋果、國光蘋果、黃元帥蘋果果皮粉末，以60%的乙醇為溶劑，以一定的液固比，在相同的提取條件下進行三次超聲波提取，合并提取液定容，然后測定黃酮得率，比較不同種類蘋果皮中黃酮的含量。

1.2.4 超聲波法提取蘋果皮黃酮單因素實驗[15]選擇黃酮含量最高的蘋果皮為原料，研究超聲波輔助提取蘋果皮黃酮的工藝條件，考察不同乙醇體積分數、提取時間、提取溫度、液固比等單因素對黃酮得率的影響。

1.2.5 響應面優(yōu)化實驗 在單因素實驗基礎上，采用Box-Behnken實驗設計優(yōu)化蘋果皮黃酮提取工藝參數[16]。采用統計分析軟件SAS9.0進行4因素3水平的響應面分析實驗[11]，實驗因素水平見表1。

表1 Box-Behnken實驗因素水平編碼表Table 1 Coded levels of variables of the Box-Behnken experimental design

2 結果與分析

2.1 不同種類蘋果皮中黃酮含量的比較

圖1 不同種類蘋果皮中黃酮含量的比較Fig.1 Comparison of flavonoid contentin differentkindsofapples

由圖1可以看出，四種蘋果皮中的黃酮含量差異很大，其中花牛蘋果皮中黃酮含量最高，國光蘋果皮黃酮含量最低，四種蘋果黃酮含量大小依次為花牛>紅富士>黃元帥>國光。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對黃酮得率的影響 由圖2可知，在超聲溫度50℃、超聲功率300W、液固比50∶1、超聲時間30m in條件下，乙醇體積分數為60%左右時，蘋果皮黃酮提取率較高。

圖2 不同乙醇體積分數對黃酮得率的影響Fig.2 Effectofdifferentethanolconcentrationson flavonoid yield

2.2.2 液固比對黃酮得率的影響 由圖3可知，在乙醇體積分數60%，超聲溫度50℃，超聲功率300W，超聲時間30m in條件下，液固比為30∶1左右時，蘋果皮黃酮提取率較高。

圖3 不同液固比對黃酮得率的影響Fig.3 Effectof different ratio of solutions tomaterial on flavonoid yield

2.2.3 超聲提取時間對黃酮得率的影響 由圖4可知，在乙醇體積分數60%，超聲溫度50℃，超聲功率300W，液固比30∶1條件下，提取時間為50min時黃酮得率較高。

圖4 不同提取時間對黃酮得率的影響Fig.4 Effectof differentextraction time on flavonoid yield

2.2.4 超聲溫度對黃酮得率的影響 由圖5可知，在乙醇體積分數60%，超聲功率300W，液固比50∶1，超聲時間50m in條件下，蘋果皮黃酮得率隨溫度的升高而增大，當溫度超過50℃時逐漸趨于平穩(wěn)，故超聲波提取蘋果皮黃酮的溫度控制在50℃為宜。

圖5 不同提取溫度對黃酮得率的影響Fig.5 Effectofdifferentextraction temperature on flavonoid yield

2.3 響應面優(yōu)化實驗結果分析

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and its results

2.3.1 回歸模型的建立與分析 以乙醇體積分數（X1）、液固比（X2）、溫度（X3）3因素為自變量，黃酮得率（Y）為響應值，進行響應面分析實驗，得出了不同實驗條件下所提取的蘋果皮黃酮得率（表2）。

2.3.2 模型的建立及分析 利用SAS9.0對表2的實驗數據進行方差分析、參數估計及顯著性檢測，具體結果分析見表3，并得到標準形式的三元二次回歸方程：

由表3可知，影響超聲波輔助提取蘋果皮中黃酮含量大小順序為X1>X2>X3，即乙醇體積分數>液固比>提取時間。從回歸分析結果來看，此模型的P＜0.01，響應面回歸模型達到顯著水平，決定系數R2為0.950。逐項顯著性檢驗結果表明，一次項、二次項對實驗結果有顯著性影響；交互項X1X3對實驗結果的影響顯著；殘差項各項數據分析表明，該模型失擬P=0.0718>0.05不具有高顯著性；因此該二次方程能夠較好地擬合真實的響應面。

2.3.3 響應曲面分析與優(yōu)化 為了考察三因素間的交互作用情況，采用design exper7.0軟件對回歸模型進行降維分析，并得到任意兩因素響應曲面圖和等高線圖，如圖6～圖8所示。

由圖6～圖8可以看出，乙醇體積分數和液固比之間、乙醇體積分數和提取時間之間的交互作用顯著，相比較而言，提取時間和液固比之間的交互作用較小。從圖6可以看出，乙醇體積分數、液固比對蘋果皮黃酮提取率的影響最大，隨著乙醇體積分數和液固比的增加，蘋果皮黃酮提取率呈現先上升后下降的趨勢，兩個因素與黃酮得率之間的變化符合所建立的響應面模型方程。

2.3.4 最佳工藝參數的確定和驗證 利用SAS9.0RSREG Procedure分析數據軟件得到表4。從特征值分析結果可以看出，其特征值均為負值，因此在曲面內有最大響應值（點），這種情況都可直接從曲面找出最優(yōu)工藝參數，且無需用嶺脊回歸尋優(yōu)分析，所得到的該穩(wěn)定點即為理論上的最佳點[14]。

表3 二次響應面回歸模型方差分析及參數估計Table 3 Analysis of variance and parameter estimate of the regressionmodel of quadratic response

進一步驗證模型分析結果，在乙醇體積分數50.3%、液固比值28.9、時間49.1m in條件下進行重復提取工藝實驗驗證，實驗重復三次，得到蘋果皮黃酮得率為（19.32±0.16）mg/g（n=3），與本研究中所建立的響應面模型分析結果中的預測值19.495686mg/g比較接近。按實際提取工藝情況，可將乙醇體積分數50.3%、液固比28.9∶1、時間49.1m in作為超聲波輔助法提取花牛蘋果皮黃酮的最佳工藝參數。

表4 典型相關和特征值分析結果Table 4 Canonical and eigenvalues analysis of test results

圖6 Y=f（X1，X2）響應曲面圖及其等高線Fig.6 Response curved surface figure and its equal-height line of Y=f（X1，X2）

圖7 Y=f（X1，X3）響應曲面圖及其等高線Fig.7 Response curved surface figure and its equal-height line of Y=f（X1，X3）

圖8 Y=f（X2，X3）響應曲面圖及其等高線Fig.8 Response curved surface figure and its equal-height line of Y=f（X2，X3）

3 結論

采用超聲波輔助法提取蘋果皮黃酮，首次篩選出花牛蘋果皮中的黃酮含量最高。在單因素實驗的基礎上采用響應面法對提取過程中的各因素進行了優(yōu)化，得出其最佳工藝條件為：乙醇體積分數50.3%、液固比28.9∶1、時間49.1min，黃酮得率為19.32mg/g。

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Optim ization of ultrasonic wave-assisted extraction process of flavonoids from app le peels

JIAO Yan1，2，CHANG Ying1，*

（1.College of Food and Biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China；2.Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China）

The extraction p rocess of flavonoids from app le peels by the ultrasonic assisted technique was stud ied.Based on sing le factor test，response surface methodology（RSM）was used to study effec t of the ethanol concentrations，ratio of solutions to material，extraction time on extraction rate of flavonoids.The best extraction conditions were determ ined as follows：ethanol concentrations 50.3%，ratio of solutions to material 28.9∶1，time 49.1m in，the flavonoids yield was 19.32mg/g.

app le peels；flavonoids；ultrasonic wave extrac tion；response surface method；p rocess cond itions

TS255.1

B

1002-0306（2012）09-0283-04

2011－08－23 *通訊聯系人

焦巖（1981－），男，博士，講師，研究方向：生物活性物質與功能食品。