有機溶劑對多聚半乳糖醛酸酶催化動力學(xué)的影響

劉小林，李曉婷，龔國勇，黃 磊，黃卓烈，伍志權(quán)，黎春怡

(1.宜春學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 宜春 336000；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；3.江西宜春中學(xué)，江西 宜春 336000)

有機溶劑對多聚半乳糖醛酸酶催化動力學(xué)的影響

劉小林1,2，李曉婷1，龔國勇1，黃 磊3，黃卓烈2，伍志權(quán)2，黎春怡2

(1.宜春學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 宜春 336000；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；3.江西宜春中學(xué)，江西 宜春 336000)

以水溶性低分子質(zhì)量殼寡糖作為修飾劑對已純化的多聚半乳糖醛酸酶進行化學(xué)修飾，得到化學(xué)修飾酶。再以有機溶劑甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃為效應(yīng)物，果膠為反應(yīng)底物，研究其在緩沖液和不同有機溶劑中多聚半乳糖醛酸酶(PG)及其化學(xué)修飾酶(COS-PG)的動力學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：修飾后，在緩沖液中COS-PG的Km值有所下降，Vmax上升。在2%的甲醇、乙醇處理后，PG和COS-PG的Km和Vmax均下降。在2%四氫呋喃處理后，PG和COS-PG的Km和Vmax均上升。在2%丙酮處理后，PG和COS-PG的Km上升，而Vmax下降。

多聚半乳糖醛酸酶；有機溶劑；動力學(xué)

多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，EC3.2.1.15，PG)是降解植物果膠骨架結(jié)構(gòu)的主要酶之一[1]，能隨機地從多聚半乳糖醛酸內(nèi)部打開α-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生聚合度為10～14的寡聚半乳糖醛酸[2]，與植物果實的軟化，脫落和種子成熟，植物組織的抗病性有關(guān)[3-6]。此外，PG在食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)、化妝品業(yè)、造紙業(yè)等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用，是當今國際研究領(lǐng)域的熱點。

酶促反應(yīng)動力學(xué)是研究酶促反應(yīng)速度的規(guī)律及某些因素對酶促反應(yīng)速度影響的科學(xué)。這對于了解酶的作用機制、確定有效的酶促反應(yīng)環(huán)境有著十分重要的作用。Km值是酶的特征性常數(shù)，測定Km值是研究酶促反應(yīng)動力學(xué)的一種重要方法。有機相中酶促反應(yīng)的過程、機制與水相中是相同的，符合米氏方程、乒乓反應(yīng)機制[7-8]。研究表明，影響有機介質(zhì)中酶促反應(yīng)動力學(xué)變化的因素涉及底物和溶劑的性質(zhì)[7-9]。酶和溶劑競爭底物，如果底物與溶劑的親和性高，則底物與酶的親和力低，Km值就大；如果底物與溶劑的親和力低，酶和底物的親和力高，Km值就小。

近10幾年來，多聚半乳糖醛酸酶的分子生物學(xué)研究進展很快，主要集中在多聚半乳糖醛酸酶及其序列特征、多聚半乳糖醛酸酶基因及其序列特征、多聚半乳糖醛酸酶的表達調(diào)控以及與病原真菌致病力之間的關(guān)系等方面[10-13]。孫沈魯?shù)萚14]探討了高壓脈沖電場(pulsed electric fields，PEF)對多聚半乳糖醛酸酶活性及構(gòu)象影響，研究表明，PEF處理可以有效地抑制PG的活性，隨著電場強度和脈沖個數(shù)的增加，酶活下降幅度增大。同時，PEF作用使酶的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。程桂平等[15]研究了pH值、溫度和金屬離子對內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)降解香蕉果膠多糖的影響。劉小林等[16]研究了EDTA和金屬離子對多聚半乳糖醛酸酶酶活力及其動力學(xué)的影響。但至今少見有報道有機溶劑對PG及其化學(xué)修飾酶動力學(xué)的影響研究。

本實驗主要研究PG和PG用水溶性低分子質(zhì)量殼寡糖(chitosan oligosaccharide，COS)進行化學(xué)修飾后得到的化學(xué)修飾酶COS-PG在水溶性有機溶劑中的動力學(xué)參數(shù)變化，旨在為了解PG和COS-PG在水溶性有機溶劑中酶促催化反應(yīng)變化的機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

多聚半乳糖醛酸酶(PG)、考馬斯亮藍G-250 美國Fluka公司；橘子果膠(純度99%) 美國Sigma公司；其他試劑是國產(chǎn)分析純。

HWS24型電熱恒溫水浴渦 上海益恒實驗儀器有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV2000紫外-可見分光光度計 上海Unico公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量測定

參照Bradford[17]的方法，以牛血清白蛋白為標準。

1.2.2 酶活力測定

參照王小敏等[18]的方法進行改進：酶促反應(yīng)體系為pH4.0，反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)時間30min，采用DNS法測定生成的半乳糖醛酸量，在上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1μg半乳糖醛酸的酶量定義為1個單位多聚半乳糖醛酸酶酶活力(U)。

1.2.3 多聚半乳糖醛酸酶(COS-PG)的活化及制備

參照Gomez等[19]的方法，采用高碘酸鈉氧化法對酶進行活化。稱取80mg多聚半乳糖醛酸酶溶于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.0)中，將一定量的高碘酸鈉溶于5mL蒸餾水中。上述活化體系置于一定溫度培養(yǎng)箱內(nèi)避光反應(yīng)30min后，加入400μL乙二醇，迅速混勻后靜置2h，用3.0L緩沖液(pH4.0)透析過夜，得到活化的PG。

將活化后的多聚半乳糖醛酸酶中加入150mg殼寡糖，置于活化溫度下避光攪拌反應(yīng)12h，不斷攪拌，緩慢加入20mg NaBH4終止反應(yīng)，靜置2h后，用3.0L緩沖液(pH4.0)透析過夜。得到殼寡糖修飾的COS-PG。

1.2.4 動力學(xué)參數(shù)測定

參照林建成等[20]的方法，將PG置于含有磷酸氫二鈉-檸檬酸的緩沖液(pH4.0)中和含有不同體積分數(shù)有機溶劑(包括甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃)的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.0)中，55℃水浴預(yù)保溫5min，加入0.1mL PG和COS-PG，并使反應(yīng)體系中有機溶劑的終體積分數(shù)達到2%，參照1.2.2節(jié)方法，在磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.0)中，55℃條件下測定其酶活力，以底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)(1/[S])為橫坐標，以酶促反應(yīng)速率的倒數(shù)(1/V)為縱坐標，繪制Lineweaver-Burk曲線，計算出Km值和Vmax值。果膠的質(zhì)量濃度設(shè)置為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mg/mL和1.6mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 緩沖液中PG和COS-PG的動力學(xué)

圖1 PG和COS-PG在緩沖液中的Lineweaver-Burk曲線Fig.1 Lineweaver-Burk curves of PG and COS-PG in buffers

經(jīng)在緩沖液中保溫1h后測定，PG和COS-PG的Lineweaver-Burk曲線見圖1，根據(jù)雙倒數(shù)作圖法計算求出PG的Km為3.68mg/mL，Vmax為526.32U/mg pro。COS-PG的Km為2.80mg/mL，Vmax為555.56U/mg pro。修飾后，COS-PG的Km下降，Vmax上升，可見，修飾后酶對底物的親和力和最大反應(yīng)速率都上升。

2.2 PG和COS-PG在2%甲醇中的動力學(xué)

圖2 PG和COS-PG在2%甲醇中的Lineweaver-Burk曲線Fig.2 Lineweaver-Burk curves of PG and COS-PG in 2% methanol

在2%甲醇中PG和COS-PG的Lineweaver-Burk曲線如圖2所示。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法計算求出PG的Km為2.17mg/mL，Vmax為434.78U/mg pro。COS-PG的Km為2.50mg/mL，Vmax為500.00U/mg pro。與緩沖液中相比，在2%甲醇中，PG和COS-PG的Km和Vmax下降?？梢?，在2%的甲醇中，PG和COS-PG與底物的親和力上升，最大反應(yīng)速率下降。

2.3 PG和COS-PG在2%乙醇中的動力學(xué)

圖3 PG和COS-PG在2%乙醇中的Lineweaver-Burk曲線Fig.3 Lineweaver-Burk curves of PG and COS-PG in 2% ethanol

在2%乙醇中PG和COS-PG的Lineweaver-Burk曲線見圖3。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法計算求出PG的Km為3.25mg/mL，Vmax為294.12U/mg pro。COS-PG的Km為2.17mg/mL，Vmax為434.79U/mg pro。與緩沖液中相比，在2%乙醇中，PG和COS-PG的Km和Vmax下降?？梢?，在2%的乙醇中，PG和COS-PG與底物的親和力上升，最大反應(yīng)速率下降。

2.4 PG和COS-PG在2%丙酮中的動力學(xué)

圖4 PG和COS-PG在2%丙酮中的Lineweaver-Burk曲線Fig.4 Lineweaver-Burk curves of PG and COS-PG in 2% acetone

在2%丙酮中PG和COS-PG的Lineweaver-Burk曲線見圖4。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法計算出PG的Km為4.28mg/mL，Vmax為357.14U/mg pro。COS-PG的Km為4.34mg/mL，Vmax為434.78U/mg pro。與緩沖液中相比，在2%丙酮中，PG和COS-PG的Km上升，而Vmax下降。可見，在2%的丙酮中，PG和COS-PG與底物的親和力下降，最大反應(yīng)速率下降。

2.5 PG和COS-PG在2%四氫呋喃中的動力學(xué)

在2%四氫呋喃中PG和COS-PG的Lineweaver-Burk曲線見圖5。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法計算求出PG的Km為5.00mg/mL，Vmax為625.00U/mg pro。COS-PG的Km為3.75mg/mL，Vmax為625.00U/mg pro。與緩沖液中相比，在2%四氫呋喃中，PG和COS-PG的Km和Vmax均上升。可見，在2%的四氫呋喃中，PG和COS-PG與底物的親和力下降，最大反應(yīng)速率上升。

3 討論與結(jié)論

Km值是酶的特征性常數(shù)，一般只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶的濃度無關(guān)。Km值的大小反映了酶和底物親和力的強弱，如果修飾Km值變大，說明酶與作用底物的親和力減小，Km值變小，說明酶與底物的親和力增強。

本實驗結(jié)果表明，COS-PG的Km值有所下降，Vmax有較大幅度的上升，可見，修飾后酶活性的提高主要是由于酶的最大反應(yīng)速率和酶分子對底物的親和力增加共同作用而引起的。這可能是由于一方面偶聯(lián)到蛋白質(zhì)表面的殼寡糖與蛋白質(zhì)分子上的－OH基團形成氫鍵，使維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的氫鍵受到部分的破壞，使亞基肽鏈結(jié)構(gòu)趨于松散，從而降低了酶催化反應(yīng)過程中酶分子構(gòu)象改變所需要的化學(xué)能[21]，因此表現(xiàn)為Vmax大幅度上升；另一方面，殼寡糖引入酶蛋白表面后，增加酶分子表面的－，從而影響了整個酶活性中心的電荷分布，更有利于酶分子結(jié)合底物分子，因而表現(xiàn)為Km值有所下降，酶對底物的親和力上升。

在有機溶劑中，酶的動力學(xué)參數(shù)受有機溶劑的制約，與有機溶劑的濃度以及底物溶劑化有很大關(guān)系。有機溶劑可以通過改變底物和產(chǎn)物在有機溶劑與酶活性部位微水相之間的分配來影響酶的活力。這種分配效應(yīng)可以用來解釋當酶從水溶液轉(zhuǎn)移到有機溶劑中時引起的表觀Km值增大。酶的催化效率與底物(疏水性與電荷性質(zhì))和溶劑(疏水性與極性)的理化性質(zhì)有關(guān)[23-24]。本實驗結(jié)果表明，在2%的甲醇中，PG和COS-PG的Km和Vmax均下降。在2%的四氫呋喃中，PG和COS-PG的Km和Vmax均上升。說明2%的甲醇引起PG和COS-PG酶活力上升主要是通過酶對底物的親和力上升實現(xiàn)的，而2%的四氫呋喃引起PG和COS-PG酶活力上升主要是通過Vmax上升實現(xiàn)的。由此可以推斷，在2%的甲醇和四氫呋喃處理后，增加了酶分子的柔性，改變了酶催化中心的微環(huán)境，從而使底物更加容易進入酶的活性中心，并導(dǎo)致表觀的酶活性提高。在2%的乙醇處理后，PG和COS-PG的Km和Vmax下降，表明2%的乙醇引起PG和COS-PG酶活力下降主要是通過最大反應(yīng)速率下降實現(xiàn)的，并且其反應(yīng)機制類似于反競爭性抑制。在2%的丙酮處理后，PG和COS-PG的Km上升，而Vmax下降，表明2%的丙酮引起PG和COS-PG酶活力下降主要是通過酶對底物親和力下降和最大反應(yīng)速率下降共同作用實現(xiàn)的，并且其反應(yīng)機制類似于混合競爭性機制。

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Effect of Organic Solvent on Catalytic Kinetics of Polygalacturonase

LIU Xiao-lin1,2，LI Xiao-ting1，GONG Guo-yong1，HUANG Lei3，HUANG Zhuo-lie2，WU Zhi-quan2，LI Chun-yi2
(1. College of Life Sciences, Yichun University, Yichun 336000, China；2. College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China；3. Yichun Middle School, Yichun 336000, China)

Water-soluble chitosan with low molecular weight was employed to modify polygalacturonase (PG). After modification, the catalytic kinetics of PG and modified polygalacturonase (COS-PG) were investigated in buffer, methanol, ethanol, acetone and tetrahydrofuran solution using pectin as substrate. The results indicated thatKm of COS-PG revealed a slight decline, butVmax revealed an increase.Km andVmax of PG and COS-PG declined both in 2% methanol and 2% ethanol.Km andVmax of PG and COS-PG increased in 2% tetrahydrofuran solution. Conversely, in 2% acetone solution,Km increased butVmax declined.

polygalacturonase；organic solvents；dynamics

Q643.132

A

1002-6630(2012)05-0134-04

2011-04-14

劉小林(1966—)，男，副教授，博士，研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：LXL7519@yahoo.com.cn