鰱魚蛋白酶法水解產(chǎn)物的功能性質(zhì)

陳志軍，李向紅，劉永樂*，俞 健，王發(fā)祥，王建輝

(長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410014)

鰱魚蛋白酶法水解產(chǎn)物的功能性質(zhì)

陳志軍，李向紅，劉永樂*，俞 健，王發(fā)祥，王建輝

(長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410014)

采用復(fù)合蛋白酶對酸法提取的鰱魚蛋白進行水解改性。以水解鰱魚蛋白為原料，與未酶解的鰱魚蛋白作對照，考察其溶解性、起泡性、乳化性、持水性油性及流變學(xué)特性。結(jié)果表明：經(jīng)酶解后的鰱魚蛋白在pH2～10的范圍內(nèi)溶解度均在90%以上，較未酶解蛋白有明顯的改善；起泡性增加不明顯，僅為1.85%，泡沫穩(wěn)定性延長了60min；乳化性是未酶解蛋白的8倍，乳化穩(wěn)定性增加；持水、持油性降低，黏度減小。該酶法水解對鰱魚蛋白質(zhì)的部分功能性質(zhì)有一定的改善效果。

鰱魚；蛋白質(zhì)；復(fù)合蛋白酶；溶解性

魚類蛋白質(zhì)氨基酸組成及比值與人體所需的氨基酸成分接近，營養(yǎng)豐富，是優(yōu)質(zhì)動物蛋白的重要來源。許多研究表明，蛋白質(zhì)酶解有助于改善其營養(yǎng)價值和功能特性，更有利于人體吸收[1-3]。水解改性后使蛋白質(zhì)分子質(zhì)量降到一個適當(dāng)?shù)姆秶?，分子空間構(gòu)象發(fā)生改變，可獲得表面活性較為理想的水解蛋白[4]。但利用酶解技術(shù)進行蛋白高值化多集中在海產(chǎn)低值魚，而我國淡水資源豐富，特別是最重要的四大淡水魚之一——鰱魚，產(chǎn)量最高，其蛋白質(zhì)含量最高可達到26.6%，但鰱魚肉質(zhì)粗糙，口感欠佳，因此，鰱魚是水解魚肉蛋白的首選。

本實驗以復(fù)合蛋白酶水解鰱魚蛋白粉為原料，對其溶解性、乳化性、起泡性、持水持油性的功能性質(zhì)進行較為系統(tǒng)的研究，并與未酶解的鰱魚蛋白作對照，為水解鰱魚蛋白在食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚蛋白 實驗室自制[5]。

復(fù)合蛋白酶、三硝基苯磺酸(TNBS) 美國Sigma公司；標準牛血清白蛋白 上海澤龍生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2100型紫外分光光度計 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)分析儀 波通瑞華科學(xué)儀器(北京)有限公司；DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠；FD-1真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)成分的測定

蛋白質(zhì)的測定：參照GB 5511—1985《糧食、油料檢驗 粗蛋白質(zhì)測定法》中的凱氏定氮法，氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)為7.24[6]；水分的測定：參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》中的105℃恒重法；灰分的測定：參照GB 5505—1985《糧食、油料檢驗 灰分測定法》中的干法灰化法；脂肪的測定：參照GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》中的索氏抽提法。

1.3.2 鰱魚蛋白酶解物的制備

堿溶酸沉法提取的鰱魚蛋白配制成質(zhì)量濃度為3g/100mL的溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.0，加復(fù)合蛋白酶2400U/g pro，55℃恒溫酶解50min，用1mol/L的鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，然后于100℃水浴滅酶10min，5000r/min離心20min，取上清液濃縮，冷凍干燥備用[7-9]。

1.3.3 蛋白質(zhì)的溶解性

通常用氮溶解指數(shù)(nitrogen solubility index，NSI)來評價。準確稱取0.2g(精確到0.001g)蛋白樣品與20mL去離子水混合，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值(2、4、6、8、10)，回旋振蕩1h后，再分別取0.5mL，采用Folin-酚法在500nm波長處測定其吸光度，并比較其大小[10-11]。

1.3.4 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

精確稱取2.00g酶解前后樣品溶于200mL的蒸餾水中，10000r/min分散1min，量取起始泡沫體積，記錄均質(zhì)停止后10、30、60、90min時的泡沫體積，用以衡量泡沫穩(wěn)定性[12]。

1.3.5 乳化性和乳化穩(wěn)定性

乳化性(emulsifying activity index，EAI)和乳化穩(wěn)定性(emulsion stability index，ESI)測定，取30mL 0.2g/100mL酶解前后樣品溶液，加入10mL大豆色拉油，10000r/min分散1min，立即用移液槍于容器底部取樣50μL，用0.1% SDS溶液稀釋100倍，混勻后在波長500nm處測定吸光度，以SDS溶液作空白[13]。室溫放置10min后再次取樣測定。

式中：n為稀釋倍數(shù)；A為乳化液的吸光度；ρ為樣品質(zhì)量濃度/(g/mL)；φ為乳化液中油相的比例，為0.25。

式中：A0為初始乳化液的吸光度；A10min為10min后乳化液的吸光度。

1.3.6 持水性、持油性

持水性(water holdingcapacity，WHC)以每克樣品吸附水的體積表示。持油性(oil holding capacity，OHC)以每克樣品吸附油的體積表示。

準確稱取0.5g樣品(精確到0.001)與20mL去離子水或者10mL大豆油于離心管中混勻，室溫條件下靜置30min，于8000r/min條件下離心30min，測定上清液體積，體積減少量即為樣品吸水量或吸油量[14-15]。

1.3.7 流變學(xué)特性

黏度-剪切速率：固定應(yīng)變1%，剪切速率為0～100s-1，測定整個過程樣品黏度隨頻率的變化曲線。配制質(zhì)量濃度為15g/100mL的鰱魚蛋白溶液，在90℃水浴保溫30min，以未酶解鰱魚蛋白做對照。將配制好的樣品加于流變儀底部平板上，選擇直徑40mm、0°的平板并設(shè)定狹縫距離為1mm，讓板間完全充滿樣品，平板頂部涂上一薄層硅油以防止樣品水分蒸發(fā)，測定溫度恒定為(25±0.1)℃[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料鰱魚蛋白的基本成分

表1 提取后鰱魚蛋白的成分分析Table 1 Analysis of protein components extracted from silver carp

由表1可見，采用堿溶酸沉法制備的鰱魚蛋白的蛋白含量(以干基計)達到了87.15%，其他雜質(zhì)、水分及灰分含量依次降低，其中灰分及其他雜質(zhì)主要是調(diào)節(jié)pH值時產(chǎn)生的鹽分；在提取過程中部分脂肪由于不能溶解而被除去。

2.2 可溶性魚蛋白功能性質(zhì)測定

2.2.1 不同pH值條件下的溶解性

圖1 鰱魚蛋白酶解前后不同pH值條件下的溶解性Fig.1 The solubility of silver carp protein under different pH conditions before and after enzymatic hydrolysis

如圖1所示，酶解后的鰱魚蛋白在pH2～10的范圍內(nèi)溶解度均遠遠大于未酶解的鰱魚蛋白，pH5左右時兩種樣品的溶解度都出現(xiàn)不同程度的降低，這與魚肌肉蛋白的等電點在pH5左右有關(guān)，當(dāng)pH值接近等電點時，蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷量最小，與水分子相互作用最弱，而蛋白質(zhì)分子間相互靠近發(fā)生聚集，使其溶解性下降。但經(jīng)酶解后鰱魚蛋白在等電點附近溶解度的下降并不明顯，溶解性對溶液pH值的依賴性降低。蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下多肽鏈被切斷，分子質(zhì)量降低，暴露在外的極性基團如NH3+、COO－數(shù)目增加，疏水基團相對減少，親水性提高，因而酶解后蛋白質(zhì)的溶解性得到提高。

2.2.2 酶解前后起泡性和泡沫穩(wěn)定性的比較

圖2 鰱魚蛋白酶解前后的起泡性Fig.2 Foaming ability of silver carp protein before and after enzymatic hydrolysis

圖3 鰱魚蛋白酶解前后的起泡穩(wěn)定性Fig.3 Foaming stability of silver carp protein before and after enzymatic hydrolysis

蛋白形成穩(wěn)定的泡沫應(yīng)該是溶于水，能夠在液-氣界面容易濃縮，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是疏水、柔順、無序的。由圖2、3可知，酶解之后鰱魚蛋白相比未酶解蛋白起泡性僅提高了1.85%，增加并不明顯；酶解前后鰱魚蛋白的泡沫量均在10min內(nèi)大幅下降，在30min時未酶解蛋白的泡沫穩(wěn)定性降為0，而經(jīng)酶水解的蛋白在90min時才降到1%以下，可見酶解后蛋白的泡沫穩(wěn)定性稍優(yōu)于未酶解的蛋白。這是因為良好的溶解性是蛋白質(zhì)溶液形成穩(wěn)定泡沫的基礎(chǔ)，酶解后蛋白質(zhì)的溶解性提高，適度的水解有利于疏水基團的暴露有利于多肽鏈的交聯(lián)增加，形成足夠黏度和強度的黏層，使泡沫的穩(wěn)定性增加。但若是蛋白水解度過大會使多肽過度交聯(lián)，泡沫層的彈力減弱，導(dǎo)致泡沫塌陷，起泡性和泡沫穩(wěn)定性都會下降。因此要得到起泡性良好且泡沫較為穩(wěn)定的水解蛋白勢必要適當(dāng)控制水解度，使溶解性、疏水性及黏度達到一個平衡點。

2.2.3 酶解前后的乳化性及乳化穩(wěn)定性

圖4 鰱魚蛋白酶解前后的乳化性Fig.4 EAI of silver carp protein before and after enzymatic hydrolysis

圖5 鰱魚蛋白酶解前后的乳化穩(wěn)定性Fig.5 ESI of silver carp protein before and after enzymatic hydrolysis

一般來說，蛋白質(zhì)的溶解度越高就越容易形成良好的乳狀液。酶解后鰱魚蛋白質(zhì)有良好的親水性，更適宜乳化成油/水(O/W)型乳狀液。由圖4、5可知，酶解前后鰱魚蛋白質(zhì)的EAI和ESI變化：酶解后鰱魚蛋白的乳化性是未酶解蛋白的近8倍，乳狀液的穩(wěn)定時間也大幅延長。酶水解后蛋白的乳化活性高于未酶解蛋白是由于蛋白質(zhì)的適度降解使其溶解度增大，更易于在油/水界面上擴散并定位，因而能乳化能力增強；同時，多肽鏈結(jié)構(gòu)解離和伸展開來，使部分疏水基團暴露在分子表面，形成的乳液微粒直徑小，排列更為有序，降低了界面張力，從而使形成的乳濁液系統(tǒng)較為穩(wěn)定。

2.2.4 酶解前后的持水性和持油性

圖6 鰱魚蛋白質(zhì)酶解前后持水性和持油性Fig.6 WHC and OHC of silver carp protein before and after enzymatic hydrolysis

由圖6可知，鰱魚蛋白未經(jīng)酶水解時的持水性為1.5mL/g，而酶解后的鰱魚蛋白完全溶于水中，無法計算持水性確切數(shù)值；鰱魚蛋白經(jīng)酶解后持油性從2.0mL/g降至1.2mL/g，下降了40%。蛋白質(zhì)的持水持油性屬于物理截持，鰱魚蛋白因酶水解作用使得蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)被破壞，多肽鏈切斷成小分子的短肽，疏水基團減少，親水基團增多，從而使酶解后的魚肽蛋白的持水、持油性減小。

2.2.5 流變性的測定結(jié)果

圖7 酶解前后不同剪切速率條件下的黏度大小Fig.7 Viscosity of silver protein before and after enzymatic hydrolysis under different shear rates

如圖7所示，酶解前后魚蛋白在不同剪切速率之下的黏度都非常小，但未酶解的蛋白樣品黏度大于酶解后的樣品黏度；隨著剪切速率的不斷增大，酶解前后鰱魚蛋白的黏度先是急劇下降，當(dāng)剪切速率達到40s-1后變化不再明顯。酶水解后鰱魚蛋白的黏度降低與肽鏈的長度減小有關(guān)，較長的肽鏈在水溶液中解開和伸展，水合程度高，表觀黏度相對較大，而在酶的作用下多肽鏈被切斷，肽鏈的交聯(lián)和相互作用隨之減小，魚蛋白溶液的黏度相應(yīng)下降。

3 結(jié) 論

本研究以實驗室自制的鰱魚蛋白為原料，采用復(fù)合蛋白酶進行水解，并對酶解前后蛋白質(zhì)的一系列功能性質(zhì)進行研究。結(jié)果表明，水解后的蛋白質(zhì)因分子質(zhì)量降低，疏水基團相對減少，親水性提高，使其溶解度在廣泛的pH值范圍內(nèi)(包括其等電點)較未酶解的蛋白均有較大的提高的；乳化性、乳化穩(wěn)定性增加；酶解前后起泡性及泡沫穩(wěn)定性的增加不明顯，持水、持油性降低，黏度減小，這主要是由于水解過度過大使得肽鏈的交聯(lián)和相互作用減小，因此要根據(jù)特定目標產(chǎn)物的用途選擇適當(dāng)?shù)乃舛龋瑥亩_到功能性質(zhì)的最優(yōu)化。

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Functional Properties of Enzymatically Modified Silver Carp Protein

CHEN Zhi-jun，LI Xiang-hong，LIU Yong-le*，YU Jian，WANG Fa-xiang，WANG Jian-hui
(School of Chemistry and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410014, China)

Functional properties of protein hydrolysates from silver carp were studied through comparison with unhydrolyzed protein. The silver carp protein was hydrolyzed by complex protease. The results showed that after enzymatic hydrolysis, the solubility of silver carp protein was more than 90% in the pH range of pH 2－10, which was significantly higher than that of non-enzymatic hydrolyzed protein. The foaming did not exhibit obvious change, which was only 1.85%. The foam stability was extended by 60 min. The emulsifying capability was 8 fold as many as that of non-enzymatic hydrolyzed protein. Meanwhile, emulsion stability also increased. However, water-binding capacity and oil-binding capacity as well as the viscosity of hydrolysates reduced. The results indicated that enzymatic hydrolysis of protein in silver carp by complex protease could improve the functional properties, which will have practical application.

silver；protein；complex protease；solubility

TS254.1

A

1002-6630(2012)05-0062-04

2011-09-30

湖南省科技重大專項(2010FJ1007)

陳志軍(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：chen_claire@163.com

*通信作者：劉永樂(1962—)，男，教授，博士，研究方向為大宗農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)。E-mail：lyle19@163.com