口服PHA復合物對犬瘟熱疫苗免疫效果的影響

郭守興 （云南省普洱市景谷縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所 666400） 沈?qū)W文 （云南省紅河州動物疫病預防控制中心 蒙自） 肖嘯 （云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 昆明）

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口服PHA復合物對犬瘟熱疫苗免疫效果的影響

郭守興 （云南省普洱市景谷縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所 666400） 沈?qū)W文 （云南省紅河州動物疫病預防控制中心 蒙自） 肖嘯*（云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 昆明）

試驗通過選擇12只健康幼犬，隨機分成對照組和試驗組，每組6只。試驗當天進行免疫接種，試驗組每只皮下注射1頭份犬瘟熱-犬細小二聯(lián)苗，同時口服PHA復合物0.1mg/kg，對照組每只皮下注射1頭份二聯(lián)苗。各組在接種前及接種后7、14d，分別采血用CDV-Ab金標試紙條測定其抗體滴度，計算陽轉(zhuǎn)率并進行T檢驗：接種后7d，對照組陽轉(zhuǎn)率為33.3%，試驗組陽轉(zhuǎn)率為66.7%，試驗組與對照組相比，陽轉(zhuǎn)率提高約2倍；接種后14d，對照組抗體滴度平均水平為1:22.5，試驗組抗體滴度的平均水平為1:45。對照組陽轉(zhuǎn)率為66.7%，試驗組陽轉(zhuǎn)率為83.3%，試驗組比對照組相提高了16.6%。T檢驗結(jié)果顯示，試驗組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。試驗組抗體離散度縮小，在1:64~1:128之間波動。試驗表明：PHA復合物可明顯提高幼犬對犬瘟熱疫苗的抗體應答能力，是一種良好的犬瘟熱疫苗免疫增效劑。

PHA復合物 犬瘟熱疫苗 免疫效果

植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)是一種從紅蕓豆中提取的有絲分裂原，是由D-甘露糖、氨基葡糖醛酸衍生物所構(gòu)成的低聚糖輔基與蛋白質(zhì)復合物，PHA有促進淋巴細胞有絲分裂、激活淋巴細胞的作用。是一種干擾素誘導劑，不僅可以刺激機體產(chǎn)生白介素-2和干擾素，還可以刺激機體產(chǎn)生非特異性抗體[1]。據(jù)美國《Science》雜志報道，機體免疫系統(tǒng)通過識別PHA而識別病毒，并產(chǎn)生相應的抗體和其他免疫反應，以從體內(nèi)清除病毒[2]。PHA與黃芪多糖等多種中草藥聯(lián)用具有增效作用，與部分抗生素聯(lián)用具有相加作用。植物血凝素作為天然的免疫細胞激活劑具有毒副作用小、安全范圍大、無種屬特異性、不易產(chǎn)生耐藥性、不易產(chǎn)生過敏反應、無殘留、生物利用率較高的特點[3]。

由于PHA強大的增強機體非特異性免疫力的作用以及強效的抗病毒作用，其作為一種新型的天然廣譜抗病毒藥物在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中應用廣泛。在獸藥中的應用也日益廣泛。

PHA也具有多種免疫效應：能刺激多種淋巴細胞分裂增殖，是多克隆激活劑；能促進淋巴細胞釋放細胞因子，如IFN-γ、IL-2等；同時PHA可促進抗體形成，這些結(jié)果證明PHA具有強大的免疫增強作用[4]。

犬瘟熱(canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的急性、高度接觸傳染性、致死性傳染病，是當前影響?zhàn)B犬業(yè)發(fā)展的最嚴重的第一大傳染病。幼犬出生8周左右，其血清中的抗體滴度大多已經(jīng)低于免疫保護所需要的水平，必須盡快接種犬瘟熱疫苗。接種犬瘟熱疫苗后一般需要2周才能達到免疫保護所需要的中和抗體水平。幼犬在出生8周左右最易感染犬瘟熱，為使幼犬接種犬瘟熱疫苗后盡快產(chǎn)生抗體并達到免疫保護所需要的抗體水平，以及縮短幼犬易感期，特進行了此試驗。

目前，有關(guān)口服PHA對犬瘟熱病毒免疫效果影響的研究鮮見報道，本試驗通過對健康犬注射犬瘟熱-犬細小二聯(lián)苗，同時口服PHA復合物，測定犬免疫效果的變化，以研究PHA是否對犬瘟熱病毒免疫效果產(chǎn)生影響，以期為PHA在動物方面的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 本次試驗所用的12只健康犬均由康大媽流浪狗收容所提供，所有接種疫苗的犬均無過往疾病史，精神狀態(tài)良好，經(jīng)檢測抗體水平符合接種條件，不符合的均已被剔除。試驗前、后均按正常方式飼養(yǎng)，環(huán)境、飼料不變。

1.1.2 試驗藥物 PHA復合物(云南大理金明動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號20100101)、犬瘟熱-犬細小二聯(lián)苗(荷蘭英特威公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號A063A01)。

1.1.3 試驗儀器及試劑 真空貯血管(5ml，無抗凝，江西格蘭斯醫(yī)療器械有限公司)；采血針(江西洪達醫(yī)療器械集團有限公司)；離心機(上海手術(shù)器械廠)；CDV-Ab金標試紙條(韓國安捷公司，內(nèi)有稀釋緩沖液1瓶，吸液塑料管1支)

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組 將12只年齡、體重相近的健康犬隨機分成對照組和試驗組2組，每組6只。試驗組提前1周喂服PHA復合物0.1mg/kg體重，1次/d，連續(xù)給藥5d，1周后，試驗組與對照組同時接種免疫，每只試驗犬皮下注射1頭份英特威二聯(lián)苗，疫苗接種后試驗組繼續(xù)投藥，方法劑量與前次相同，連用5d，1周后，再按之前的方法再次給藥5d。整個過程，對照組均不做給藥處理。各試驗犬均按正常方式管理、飼喂。

1.2.2 血樣的采集和處理 試驗為期3周，各組在免疫接種前及接種后7、14d，分別前肢靜脈采血3ml，將所采血樣分組編號，用離心機4000轉(zhuǎn)離心5min，分離出血清。

1.2.3 抗體滴度的測定 血清處理后用CDV-Ab金標試紙條測定其抗體滴度：用包裝內(nèi)的塑料吸管吸取適量血清，滴入稀釋緩沖液中，混合均勻，吸取混合液，在試紙條的加樣孔里滴加3至4滴，室溫靜置20min，比較T線與C1、C2線的線條寬度與顏色深淺(注釋：稀釋緩沖液中含有少量的疊氮鈉作為防腐劑，該藥物有毒性，必須小心處理并且避免皮膚接觸)。

1.2.4 試驗結(jié)果判定 CDV-Ab金標試紙條判定：①C1線為低抗體水平測量對照線，抗體水平相當于1:16，C2為高抗體水平測量對照線，相當于1:128的抗體水平。②如果T線的線條寬度和顏色深淺弱于C1線，那血清的抗體水平判定就以C1為準，具體方法是：如果T線不出現(xiàn)，則該血清抗體水平為0，如果T線線條寬度和顏色深淺是C1線的1/4，則抗體水平為1:2，是C1線的1/3則抗體水平為1:4，是C1線的1/2時，抗體水平為1:8，如果與C1相近則為1:16。③如果T線的線條寬度和顏色深淺強于C1線而弱于C2線，則該血清的抗體水平判斷就以C2線為準，具體方法是：如果T線線條寬度和顏色深淺是C2線的1/3，則抗體水平為1:32，如果是1/2，則抗體水平為1:64，如果與C2相近則為1:128，其中1:32的抗體水平為臨界值，1:64以上為合格。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS統(tǒng)計軟件，按照生物統(tǒng)計學上的分析方法對檢測的各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理和分析，P<0.05表示差異顯著和P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種前對照組和試驗組的抗體滴度水平

表1 接種前對照組組與試驗組組的抗體滴度水平

由表1可知，接種犬瘟熱-犬細小二聯(lián)疫苗前，對照組與試驗組犬的抗體滴度水平基本相同，平均值皆為1:3，兩組的犬瘟熱抗體陽轉(zhuǎn)率都為0。T檢驗顯示兩組間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 免疫接種后7d對照組和試驗組的抗體滴度水平

表2 免疫接種后7d各組的抗體滴度水平

由表2可知，接種疫苗后7d，試驗組抗體滴度的平均水平達到1:29.5，比對照組提高了48.14%。對照組陽轉(zhuǎn)率為33.3%，試驗組陽轉(zhuǎn)率為66.7%，試驗組與對照組相比，陽轉(zhuǎn)率提高約2倍。T檢驗結(jié)果顯示，試驗組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.3 免疫接種后14d對照組和試驗組的抗體滴度水平

接種疫苗后14d，對照組抗體滴度平均水平為1:22.5，試驗組抗體滴度的平均水平達到1:45。對照組陽轉(zhuǎn)率為66.7%，試驗組陽轉(zhuǎn)率為83.3%，試驗組比對照組相提高了16.6%(見表3)。T檢驗結(jié)果顯示試驗組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。試驗組抗體離散度縮小，在1:64~1:128之間。

表3 免疫接種后14d各組的抗體滴度水平

3 討論

據(jù)報道，目前有許多研究表明PHA可以與疫苗同時使用，能起到彌補免疫空白期、減緩疫苗應激反應、增強免疫效果的作用。莫非等人研究了植物血凝素(PHA)對雞免疫功能的影響，結(jié)果表明PHA對機體的細胞免疫和體液免疫均有較強的促進作用，PHA對人工感染雞新城疫病毒有保護力[5]。陳東明等(2006)[6]報道利用PHA增強了小鼠特異性體液免疫的效應。張明珠等(2009)[7]在試驗植物血凝素對雞新城疫疫苗免疫效果的影響中，采用滴鼻的途徑，對肉用雛雞進行新城疫Ⅳ系苗免疫接種過程中，同時輔助使用植物血凝素(PHA)，可明顯提高機體特異性抗體的水平，因而能夠有效地增強雞新城疫疫苗的免疫效果。

通過對健康犬注射犬瘟熱-犬細小二聯(lián)苗，同時口服PHA復合物，測定犬免疫效果的變化，發(fā)現(xiàn)在免疫接種前2組抗體滴度水平基本相同，無免疫保護作用。接種疫苗后7d，對照組陽轉(zhuǎn)率為33.3%，試驗組陽轉(zhuǎn)率為66.7%，試驗組與對照組相比，陽轉(zhuǎn)率提高約2倍。試驗組抗體滴度的平均水平比對照組提高了48.14%。到免疫接種后14d，試驗組抗體滴度的平均水平為1:45，達到了保護犬免受犬瘟熱病毒感染所需的基礎抗體滴度水平(1:32)。陽轉(zhuǎn)率試驗組與對照組相比提高了16.6%，且T檢驗結(jié)果顯示，試驗組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。試驗組抗體離散度縮小，在1:64~1:128之間。這表明給犬免疫注射犬瘟熱-犬細小二聯(lián)苗的同時，口服0.1mg/kg PHA復合物，可促進機體對疫苗株感染做出免疫應答，對幼犬抵抗犬瘟熱病毒的攻擊可能起到積極的預防作用，由此顯示PHA可以作為高效免疫增強劑與疫苗合用來提高疫苗的免疫效果。

接種疫苗后14d，對照組陽轉(zhuǎn)率為66.7%，試驗組陽轉(zhuǎn)率為83.3%，效果不明顯，為了加強免疫效果還要進行二免，甚至三免。提高幼犬對犬瘟熱病毒病的抵抗力。

肖嘯等(2011)[8]給不同試驗組豬肌注低劑量(0.2ml/kg)、中劑量(0.4ml/kg)、高劑量(0.8ml/kg)的PHA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，低劑量組和中劑量組淋巴細胞都有了不同程度的提高，但中劑量組提高的較高，顯示適量的PHA能顯著地促進淋巴細胞提高，增強免疫功能。另有學者報道，PHA對雞新城疫，豬圓環(huán)病毒病、豬傳染性胃腸炎、非典型豬瘟等有免疫促進作用[9,10]，與本研究的結(jié)果基本一致。在實際免疫中，為更好地抵御犬瘟熱病毒的感染，還需要在首次免疫后的2~3周進行加強免疫。本試驗因條件限制，未能開展攻毒和中和試驗，以及不同劑量梯度的對比試驗，所以對免疫保護時間能提前多少天，最適宜的口服劑量等問題，還有待進一步研究。

4 結(jié)論

（1）對犬注射犬瘟熱-犬細小二聯(lián)苗，同時口服一定劑量PHA復合物，能極顯著提高機體抗體滴度水平，陽轉(zhuǎn)率也得到較大提高，且離散度明顯縮小，免疫效果更好。（2）給犬免疫注射犬瘟熱-犬細小二聯(lián)苗，同時口服PHA復合物，可促進機體對疫苗株感染做出免疫應答，對犬抵抗犬瘟熱病毒的攻擊可能起到積極的預防作用，由此顯示PHA可以作為高效免疫增強劑與疫苗合用來提高疫苗的免疫效果。

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（2011–11–03）

云南省高端科技人才引進計劃項目子項目，項目編號2009C11256，云南省教育基金項目

S853.76

A

1007-1733(2012)02-0005-03