蝦類(lèi)保藏過(guò)程中酚氧化酶酶促黑變作用機(jī)理及其抑制方法的研究進(jìn)展

錢(qián)韻芳，謝 晶，吳文惠

（上海水產(chǎn)品加工與保藏工程中心，上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

蝦類(lèi)保藏過(guò)程中酚氧化酶酶促黑變作用機(jī)理及其抑制方法的研究進(jìn)展

錢(qián)韻芳，謝 晶*，吳文惠

（上海水產(chǎn)品加工與保藏工程中心，上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

在蝦類(lèi)貯藏過(guò)程中，蝦體的黑變嚴(yán)重影響了蝦的感官品質(zhì)，酚氧化酶是催化酪氨酸等色原物質(zhì)轉(zhuǎn)化為黑色素造成蝦體黑變的主要因素。文章綜述了國(guó)內(nèi)外酚氧化酶的形成機(jī)制研究現(xiàn)狀，重點(diǎn)敘述了蝦類(lèi)中酚氧化酶的特性及抑制蝦類(lèi)黑變方法的研究進(jìn)展，為蝦類(lèi)貯藏保鮮技術(shù)的研發(fā)與改進(jìn)提供參考。

蝦，黑變，酚氧化酶，機(jī)理，防黑變方法

蝦是一種肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富的水產(chǎn)品，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。然而蝦肉中蛋白質(zhì)含量較高，為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供了有利條件。因此，蝦類(lèi)在保藏過(guò)程中易受微生物的侵染而腐敗變質(zhì)。此外，蝦肉中含有酚氧化酶（Phenoloxidase，PO），在酚氧化酶作用下，蝦體中的單酚類(lèi)化合物氧化生成無(wú)色的醌類(lèi)物質(zhì)，醌類(lèi)物質(zhì)再轉(zhuǎn)化形成黑色聚合物，導(dǎo)致蝦體黑變[1]。蝦類(lèi)保藏、銷(xiāo)售過(guò)程中，蝦體黑變是影響蝦類(lèi)外觀品質(zhì)、降低蝦類(lèi)產(chǎn)品商品價(jià)值的主要因素。因此，在蝦類(lèi)保藏過(guò)程中，除了抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，還需采取有效措施防止蝦體黑變。了解蝦體中酚氧化酶的理化、生物特性及其作用底物和蝦類(lèi)黑變產(chǎn)生機(jī)制，可以為探尋有效防止蝦類(lèi)黑變的新途徑提供方向。本文綜述了蝦類(lèi)酚氧化酶的理化特性、蝦體中黑色素形成機(jī)理以及防黑變劑和加工方法在防蝦體黑變中應(yīng)用的研究進(jìn)展，以期為蝦類(lèi)產(chǎn)品保藏技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 酚氧化酶概述

1.1 酚氧化酶的定義和分類(lèi)

酚氧化酶是一類(lèi)廣泛存在于甲殼綱動(dòng)物、果蔬、甚至人體皮膚中的含銅金屬酶，同時(shí)也是引起甲殼綱動(dòng)物黑變、果蔬褐變[2-3]以及人體皮膚黑色素沉淀[4]的關(guān)鍵酶。

按照催化底物酚基數(shù)量的不同，酚氧化酶可分為單酚氧化酶（Monophenoloxidase，EC 1.14.18.1）、雙酚氧化酶（o-diphenoloxidase，EC 1.10.3.1）和漆酶（Laccases，EC 1.10.3.2）[5]。

自然界中存在多種酚氧化酶的同工酶。不同來(lái)源的酚氧化酶的名稱(chēng)因作用底物不同而不同，蝦類(lèi)中存在的單酚酶以酪氨酸為主要底物，因此又稱(chēng)為酪氨酸酶（Tyrosinase），雙酚酶則又被稱(chēng)為兒茶酚酶（Catecholoxidase）[6]。研究發(fā)現(xiàn)，單酚酶同時(shí)具有雙酚酶活性[7]，因此蝦類(lèi)中的酚氧化酶一般又可稱(chēng)為酪氨酸酶。

1.2 酚氧化酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與生化特性

目前，相關(guān)科研工作者還沒(méi)有提取到較純的酚氧化酶結(jié)晶，因此對(duì)于酚氧化酶空間結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道較少。但研究認(rèn)為酚氧化酶原序列中有兩個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)（CuA和CuB），每個(gè)位點(diǎn)由3個(gè)保守的組氨酸殘基和1個(gè)銅離子以非共價(jià)鍵連結(jié)而成，每?jī)蓚€(gè)銅離子能夠束縛一個(gè)氧分子[8]。當(dāng)酚氧化酶催化酪氨酸等底物時(shí)，底物中的羥基先與該活性中心的原子鍵合發(fā)生作用[9-10]。

酚氧化酶的分子量、最適pH、溫度等生化特性與蝦的種類(lèi)有關(guān)。表1列出了幾種蝦類(lèi)酚氧化酶的分子量大小、最適pH和最適溫度。

2 酚氧化酶的生理學(xué)作用與激活機(jī)制

2.1 酚氧化酶的生理學(xué)作用

要尋求能夠有效抑制酚氧化酶的方法，首先需要了解酚氧化酶的生理學(xué)作用。一般研究認(rèn)為，酚氧化酶參與了生物體免疫和自身識(shí)別系統(tǒng)[18-19]生理作用，包括以下兩點(diǎn)：a.參與甲殼動(dòng)物的外殼硬化；b.修復(fù)傷口：蝦類(lèi)等甲殼動(dòng)物都通過(guò)醌類(lèi)聚合過(guò)程生成抗菌化合物來(lái)幫助傷口愈合。

2.2 酚氧化酶的激活機(jī)制

在節(jié)肢動(dòng)物中，酚氧化酶一般以無(wú)活性的酚氧化酶原（Prophenoloxidase，pro-PO）的形式存在于血細(xì)胞中，與模式識(shí)別蛋白、絲氨酸蛋白酶等一同構(gòu)成了復(fù)雜的酚氧化酶原激活系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)一些外源多糖（微生物細(xì)胞壁的主要成分）能夠刺激凡納濱對(duì)蝦的免疫活性[20]，如酵母多糖（提取自啤酒糖酵母）、葡聚糖（提取自啤酒糖酵母菌）、脂多糖（提取自大腸桿菌O111）、肽聚糖（提取自橙黃微球菌）等。這些多糖類(lèi)物質(zhì)能與分子識(shí)別蛋白結(jié)合，激活酚氧化酶原，其中以肽聚糖的作用最為顯著。

血藍(lán)蛋白是一種存在于節(jié)肢動(dòng)物血淋巴中的藍(lán)色、含銅、類(lèi)似血紅蛋白功能的攜氧蛋白質(zhì)，與酚氧化酶（PO）具有較高的同源性，尤其活性位點(diǎn)的相似度很高。有研究表明，在一定條件下，血藍(lán)蛋白在胰蛋白酶水解下能夠表現(xiàn)出酚氧化酶的活性[21-22]。因此，血藍(lán)蛋白可能是節(jié)肢動(dòng)物血淋巴的酚氧化酶原[23-24]。

2.3 酚氧化催化黑色素合成路徑

酚氧化酶催化酚類(lèi)化合物生成無(wú)色醌類(lèi)物質(zhì)，這些醌類(lèi)物質(zhì)在非酶促反應(yīng)下聚合生成黑色素（反應(yīng)過(guò)程見(jiàn)圖1），并釋放抑菌物質(zhì)[25-27]。由此可見(jiàn)，酚氧化酶原激活系統(tǒng)是活體蝦及其他節(jié)肢動(dòng)物起保護(hù)作用的一種免疫反應(yīng)機(jī)制。

我國(guó)是一個(gè)地域廣大的統(tǒng)一多民族國(guó)家,悠久的歷史與文化在建筑上形成了不同地域迥異的建筑形式和風(fēng)格,例如徽派建筑、福建土樓等等,共同構(gòu)成了我國(guó)豐富多彩的傳統(tǒng)民居。這些傳統(tǒng)民居反映了一個(gè)地區(qū)特有的自然、社會(huì)、歷史、文化，是我國(guó)建筑文化的重要標(biāo)志。

圖1 酪氨酸氧化生成黑色素反應(yīng)路徑[9]Fig.1 Formation ofmelanin from tyrosine[9]

3 國(guó)內(nèi)外蝦類(lèi)黑變抑制方法研究進(jìn)展

3.1 蝦類(lèi)黑變抑制劑

由于苯醌類(lèi)物質(zhì)的聚合反應(yīng)是非酶促反應(yīng)，因此抑制黑變的研究以抑制前體物質(zhì)的形成為主。酚氧化酶的抑制方法可分為可逆型抑制和不可逆型抑制兩大類(lèi)，其中可逆型抑制又可分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要使用還原劑與抗氧化劑、隔氧成膜劑、金屬離子螯合劑以及酚氧化酶結(jié)構(gòu)類(lèi)似物等防黑變劑來(lái)防止或延緩蝦體死后黑變。

3.1.1 還原劑與抗氧化劑 二氧化硫產(chǎn)生物（亞硫酸鹽、焦性亞硫酸鹽等）是使用較為普遍和有效的蝦類(lèi)黑變抑制劑[28]。然而，亞硫酸鹽添加到食品中存在嚴(yán)重的安全隱患，低劑量SO2仍可能引起部分人群發(fā)生頭暈、腹痛、惡心甚至過(guò)敏性休克等癥狀[29-30]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織以及美國(guó)、日本、歐盟等國(guó)家都嚴(yán)格規(guī)定了蝦肉中SO2的殘留量不得超過(guò)0.1mg/g[31]。

抗壞血酸（L-ascorbic acid，Vitam in C）又稱(chēng)維生素C。因其具有較強(qiáng)的還原性和安全性，以及能夠防止黑色素沉集而應(yīng)用在蝦類(lèi)防黑變中。研究表明抗壞血酸能夠?qū)⒈锦€原成雙酚[32]。但也有研究認(rèn)為在蝦類(lèi)的保藏過(guò)程中添加抗壞血酸會(huì)使蝦體產(chǎn)生特殊的黃色，影響蝦的感官品質(zhì)[33]。異抗壞血酸是抗壞血酸的D型異構(gòu)體。雖然異抗壞血酸不具備抗壞血酸的生理功能，但是具有和抗壞血酸近似的抗氧化性而被用于防止蝦類(lèi)貯藏過(guò)程中產(chǎn)生的黑變。

巰基化合物如半胱氨酸、谷胱甘肽等在生物體中參與氧化還原反應(yīng)。其中半胱氨酸是人體非必需氨基酸，而谷胱甘肽是由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸3個(gè)氨基酸脫水縮合而成，能夠抑制日本對(duì)蝦的黑變[34]。

表1 部分種屬蝦類(lèi)酪氨酸酶的生化特性Table 1 Physiochemical properties of polyphenol oxidase from different shrimp species

3.1.2 隔氧成膜劑 可食性涂膜抑制蝦類(lèi)黑變的主要作用原理是阻隔蝦類(lèi)與氧氣、水以及空氣中微生物的接觸[35]，因而對(duì)蝦體酚類(lèi)物質(zhì)的氧化和黑變起到一定的抑制作用[36]。

生物涂膜劑按其成分組成可分為多糖類(lèi)膜、蛋白類(lèi)膜、脂質(zhì)類(lèi)膜以及復(fù)合膜等[37]。其中殼聚糖抑制甲殼動(dòng)物黑變的效果較明顯，研究認(rèn)為這可能是因?yàn)闅ぞ厶蔷酆衔飵в姓姾?，能夠吸附帶?fù)電荷的多酚氧化酶中間產(chǎn)物或底物，并中和了負(fù)電荷，從而降低了多酚氧化酶與底物結(jié)合的概率[38]，從而抑制了蝦類(lèi)的黑變。

3.1.3 金屬離子螯合劑 酚氧化酶的活性中心有兩個(gè)銅離子，能夠結(jié)合氧分子，為底物氧化提供氧。如果酚氧化酶的Cu脫離酶活性中心，酚氧化酶則無(wú)法結(jié)合氧分子催化氧化反應(yīng)。金屬離子螯合劑就是針對(duì)這一原理來(lái)降低酚氧化酶活性的。目前，常用于防止蝦類(lèi)黑變的金屬離子螯合劑有乙二胺四乙酸（EDTA）[39]、植酸[40]、曲酸[41]、鞣酸等。

芳香族羧酸類(lèi)化合物如苯甲酸、肉桂酸系化合物等，也是一類(lèi)酚氧化酶的底物類(lèi)似物。研究發(fā)現(xiàn)肉桂酸及其衍生物[44]、阿魏酸[45]、芥子酸[46]、香豆酸[47]、含羞草酸[48]等都有鈍化酚氧化酶的作用。

3.1.5 天然混合物抑制劑 近年來(lái)隨著食品添加劑安全問(wèn)題越來(lái)越受公眾關(guān)注，源自天然物提取的蝦類(lèi)黑變抑制劑因其安全無(wú)害而得到越來(lái)越廣泛的研發(fā)和應(yīng)用，部分植物來(lái)源的酪氨酸酶抑制劑見(jiàn)表2。

研究表明，很多天然提取物對(duì)蝦體黑變起到了一定的抑制作用，如：綠茶提取物[49]、葡萄籽提取物[50]、銀合歡種子提取物[51]等。這些天然提取物的有效成分多為多酚類(lèi)抗氧化劑，如兒茶素[54-55]、原花青素[56]，以及如槲皮素[57]、蘆丁[58]等黃酮類(lèi)化合物。它們不僅具有很強(qiáng)的還原性，能夠清除自由基，而且水溶液穩(wěn)定性較抗壞血酸好，還有螯合銅離子和抑菌能力[59]，因此對(duì)蝦類(lèi)酚氧化酶的抑制類(lèi)型多為混合型?；鹧孀犹崛∥镏泻械亩祁?lèi)化合物則不與酚氧化酶的活性中心結(jié)合，為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制[52]。然而，由于這些提取物成分過(guò)于復(fù)雜，天然抗氧化劑的作用機(jī)理尚不明確，目前尚難從這些混合物中確定對(duì)蝦類(lèi)黑變抑制起主導(dǎo)作用的化合物。

3.2 抑制蝦類(lèi)黑變的處理加工方法

3.2.1 常規(guī)處理方法 蒸煮、漂燙是食品中常用的殺菌、滅酶方法[60-61]。經(jīng)70～90℃熱處理能夠使酚氧化酶失活，起到較好的蝦類(lèi)黑變抑制效果。但漂燙、蒸煮等熱處理會(huì)改變產(chǎn)品的顏色、風(fēng)味及質(zhì)地，還會(huì)使產(chǎn)品丟失維生素、糖及水溶性蛋白質(zhì)等可溶性營(yíng)養(yǎng)成分。

低溫保藏方式如冷藏、冰溫[62]和凍藏[63]都能夠降低酚氧化酶的活性，進(jìn)而延緩蝦體的黑變，但不能使酶失活，當(dāng)恢復(fù)到室溫時(shí)，蝦體反而會(huì)加速黑變。

酶促反應(yīng)需要在自由水含量相對(duì)較高的環(huán)境中進(jìn)行，因此水分活度AW對(duì)于酶促反應(yīng)體系顯得十分重要。一般降低水分活度的方法有：添加持水劑和干燥技術(shù)。常見(jiàn)的持水劑有鹽、多元醇、糖等，用于降低自由水含量?，F(xiàn)在干燥技術(shù)中真空冷凍干燥技術(shù)被認(rèn)為是較有效的干燥方法，能在較低的溫度下去除水分，且對(duì)食品的品質(zhì)影響較小。但冷凍干燥后的樣品更易發(fā)生氧化，因此需結(jié)合包裝技術(shù)來(lái)提高作用效果。

3.2.2 高壓處理 高壓處理技術(shù)通過(guò)改變酶的空間結(jié)構(gòu)能夠使酶部分失活或全部失活。研究表明，超高壓處理不僅能夠降低微生物菌落數(shù)，延長(zhǎng)新鮮凡納濱對(duì)蝦的貨架期，還能夠降低蝦體中酚氧化酶的活性[64-65]。但也有研究發(fā)現(xiàn)高壓處理促進(jìn)了蝦類(lèi)黑變[66]，認(rèn)為這可能與壓強(qiáng)和處理時(shí)間有關(guān)。對(duì)比超高壓技術(shù)對(duì)多酚氧化酶提取物和食品介質(zhì)中酚氧化酶活力的影響研究發(fā)現(xiàn)[67]，食品介質(zhì)可能對(duì)酚氧化酶起保護(hù)作用，因此在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中需要更高的壓力和更長(zhǎng)的處理時(shí)間來(lái)鈍化食品介質(zhì)中的酚氧化酶。

3.2.3 高密度二氧化碳處理 高密度二氧化碳是一種通過(guò)二氧化碳的分子效應(yīng)來(lái)達(dá)到殺菌和鈍化酶活效果的新型非熱加工技術(shù)，能夠在低溫條件下盡可能地保持食品的天然品質(zhì)和質(zhì)量安全[68]。研究表明，高密度二氧化碳處理通過(guò)破壞分子間作用力，改變酶的空間結(jié)構(gòu)，降低貯藏期間酚氧化酶的活力，從而抑制了蝦的黑變[69]。

3.2.4 高壓脈沖電場(chǎng)處理 高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)利用強(qiáng)電場(chǎng)脈沖來(lái)改變反應(yīng)體系的介電特性，從而降低酶的活性。在20℃下，經(jīng)過(guò)高壓脈沖電場(chǎng)（場(chǎng)強(qiáng)13～ 87kV/cm、0.5Hz，處理時(shí)間2μs）處理后，酚氧化酶的活力可降低30%～40%[70]。近幾年，在果蔬及果蔬汁等產(chǎn)品中應(yīng)用高壓脈沖場(chǎng)技術(shù)能夠達(dá)到鈍化酚氧化酶活性和防褐變的效果[71]，但在蝦類(lèi)產(chǎn)品的應(yīng)用研究較少。

表2 部分植物來(lái)源的酪氨酸酶抑制劑Table 2 Tyrosinase inhibitors from different vegetablematerials

3.2.5 氣調(diào)包裝處理 氣調(diào)包裝技術(shù)通過(guò)調(diào)節(jié)包裝內(nèi)氣體的組分達(dá)到降低蝦類(lèi)保藏過(guò)程中氧化反應(yīng)速率的目的。研究認(rèn)為[72]，低氧氣調(diào)包裝對(duì)蝦類(lèi)黑變具有較好的抑制效果，高氧氣調(diào)包裝能夠促進(jìn)蝦的黑變。

4 討論與展望

近幾年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)蝦類(lèi)產(chǎn)品防黑變方法的研究進(jìn)行了許多有益的探討：a.在防黑變劑的開(kāi)發(fā)方面，研究重點(diǎn)逐漸由單一化合物抑制黑變向復(fù)合黑變抑制劑協(xié)同作用的方向發(fā)生轉(zhuǎn)變；同時(shí)，隨著人們對(duì)食品安全的要求越來(lái)越高，化學(xué)黑變抑制劑逐漸被天然提取物所替代；b.在加工工藝方面，傳統(tǒng)熱加工技術(shù)已不能滿足人們對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)、感官品質(zhì)的要求，加工工藝逐漸向超高壓技術(shù)、高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)、氣調(diào)包裝等非熱加工處理技術(shù)轉(zhuǎn)變。

目前，研究普遍認(rèn)為蝦類(lèi)黑變的發(fā)生主要與酚氧化酶有關(guān)，但相關(guān)研究者多集中在養(yǎng)殖過(guò)程中通過(guò)添加免疫激活劑來(lái)提高酚氧化酶活性，進(jìn)而提高蝦類(lèi)養(yǎng)殖過(guò)程中免疫力方面的研究，而對(duì)于蝦類(lèi)死后保藏過(guò)程中酚氧化酶如何被釋放、激活以及酶活的抑制機(jī)制是如何失效的研究報(bào)道較少。因此，結(jié)合蝦類(lèi)保藏特點(diǎn)和目前蝦類(lèi)黑變抑制技術(shù)的研究現(xiàn)狀，提出蝦類(lèi)黑變抑制有以下研究方向：

a.應(yīng)用柵欄技術(shù)提高蝦類(lèi)黑變抑制效果。復(fù)合多種黑變抑制劑或結(jié)合加工工藝，能夠提高單一黑變抑制劑或加工工藝抑制黑變的效果，并降低蝦類(lèi)黑變抑制劑的使用劑量或加工處理強(qiáng)度，以滿足食品安全的要求。

b.深入研究活蝦酚氧化酶的調(diào)控機(jī)制，借鑒活蝦自身的酚氧化酶活性抑制機(jī)理，從酶促反應(yīng)的前饋和反饋控制方面進(jìn)行研究，模擬活蝦酚氧化酶的調(diào)控機(jī)制來(lái)人為干預(yù)蝦類(lèi)死后酚氧化酶的活性調(diào)控，從而獲得蝦類(lèi)黑變抑制的有效方法。

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Research progress inmelanosismechanism of shrim p products induced by phenoloxiade and the use of anti-melanosis techniques during preservation

QIAN Yun-fang，XIE Jing*，WUW en-hui
（Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing&Preservation，College of Food Science and Technology，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China）

Melanosis in shrim p reduces the customers’accep tability d rastically，leading to the decreasing of market values and considerab le financial loss，which is triggered by a kind of enzymes called phenoloxidase. Phenoloxidase oxid izes tyrosine to quinine lead ing to b lack high molecular weight p igment.Studies on the mechanism s of phenoloxidase activation system and phenoloxidase inhibitory methods domestically and ab road were reviewed，in order to p rovide information for further study and development in shrimp p reservation techniques.

shrim p；melanosis；phenoloxidase；mechanism；anti-melanosis methods

TS254.1

A

1002-0306（2012）22-0400-06

2012－08－03 *通訊聯(lián)系人

錢(qián)韻芳（1985-），女，博士研究生，研究方向：食品保鮮。

“十二五”國(guó)家支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD29B06）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金（20113104110005）；上海市科委工程中心建設(shè)（11DZ2280300）。