大豆低聚肽降膽固醇作用研究

程天德，張 韜，梁延省

（1.清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東清遠(yuǎn) 511510；

2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州 510642）

大豆低聚肽降膽固醇作用研究

程天德1，張 韜1，梁延省2

（1.清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東清遠(yuǎn) 511510；

2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州 510642）

目的：研究大豆低聚肽在降膽固醇方面的作用。方法：取5周齡SD雄性大鼠90只，隨機(jī)分為6組（每組15只），即Ⅰ（對(duì)照組）、Ⅱ（蛋白組）、Ⅲ（多肽組）、Ⅳ（低聚肽組1）、Ⅴ（低聚肽組2）、Ⅵ（低聚肽組3），在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，構(gòu)建高膽固醇模型，在對(duì)各組繼續(xù)飼喂高膽固醇飼料的同時(shí)，對(duì)第Ⅱ組口腔灌喂大豆蛋白，對(duì)第Ⅲ組口腔灌喂大豆多肽，對(duì)第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組分別灌喂不同劑量的大豆低聚肽，第Ⅰ組口腔灌喂同體積的飲用水。飼喂6周，分別收集糞便、血清和肝臟，測(cè)定血清和肝臟中的膽固醇和甘油三酯含量、糞便重量及其中的類固醇含量。結(jié)果：第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組血清和肝臟中的膽固醇和甘油三酯含量均有不同程度的降低，大鼠糞便的排泄量及糞便中類固醇的含量增加。大豆低聚肽組有劑量依賴性，高劑量大豆低聚肽組效果極顯著。結(jié)論：大豆低聚肽具有比大豆蛋白和大豆多肽更強(qiáng)的降低膽固醇的作用，且這種作用具有劑量依賴性。

大豆低聚肽，降膽固醇，大豆蛋白，大豆多肽

大豆在我國(guó)有悠久的食用歷史，隨著科技的發(fā)展，大豆被加工成各類食品出現(xiàn)在人們的生活中，其中，大豆肽就是近年來研究得最熱門的大豆生物活性物質(zhì)之一。隨著研究的進(jìn)一步深入，分子量較小的大豆低聚肽被認(rèn)為具有比大豆蛋白和大豆多肽更強(qiáng)的生物活性[1]，但有關(guān)大豆低聚肽在降膽固醇方面的研究還鮮有報(bào)道，因此我們選用分子量1000以下的大豆低聚肽[2]來觀察其對(duì)大鼠膽固醇的影響，同時(shí)比較其與大豆蛋白和大豆多肽在降低膽固醇活性方面的強(qiáng)弱，為我們探討大豆低聚肽的生物活性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白 實(shí)驗(yàn)室堿提酸沉法制得；大豆多肽 分子量5000以上，實(shí)驗(yàn)室自制；大豆低聚肽[2]分子量1000以下，實(shí)驗(yàn)室自制；年輕雄性SD大鼠 體重90～120g；基礎(chǔ)飼料 參考美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦配方[3]（玉米50.32%、面粉10%、豆餅20%、魚粉14%、酵母2%、骨粉1.4%、蛋氨酸0.18%、食鹽1.0%、植物油1.1%）；高脂飼料 在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上添加膽固醇和膽汁酸（每100g高脂飼料中含：膽固醇5%、膽汁酸0.125%）。

GC-15氣相色譜儀 日本島津；自動(dòng)生化分析儀PUZS-300 南京普朗；離心機(jī)，組織搗碎機(jī)，解剖器械等。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 高膽固醇模型建立 5周齡SD雄性大鼠90只，體重90～120g，隨機(jī)分為6組，每組15只，即Ⅰ（對(duì)照組）、Ⅱ（蛋白組）、Ⅲ（多肽組）、Ⅳ（低聚肽組1）、Ⅴ（低聚肽組2）、Ⅵ（低聚肽組3），在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，各組分別飼喂基礎(chǔ)飼料1周，尾靜脈取血，以肝素鈉抗凝，在4℃冰箱中析出血清，測(cè)定血清中總膽固醇和甘油三脂的含量。然后開始各組飼喂高膽固醇飼料2周，尾靜脈取血并測(cè)定血清中膽固醇和甘油三酯的含量，與飼喂高膽固醇前的血清膽固醇和甘油三脂含量比較，確定高膽固醇模式是否建成。

1.2.2 飼喂實(shí)驗(yàn) 高膽固醇模型建成后，根據(jù)1.2.1的分組，在對(duì)各組繼續(xù)飼喂高膽固醇飼料的同時(shí)，對(duì)第Ⅱ組口腔灌喂大豆蛋白（0.1g/d），對(duì)第Ⅲ組口腔灌喂大豆多肽（0.1g/d），對(duì)第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組分別灌喂不同劑量（0.1、0.2、0.5g/d）的大豆低聚肽，第Ⅰ組口腔灌喂同體積的飲用水。飼喂6周，每周六、日分別收集糞便冷凍干燥保藏用以測(cè)定類固醇含量。6周后，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，尾靜脈取血，測(cè)定血清中的膽固醇和甘油三酯含量。取其肝臟，按組織重量（g）∶生理鹽水體積（m L）為1∶9制成組織勻漿，離心取上清液測(cè)定膽固醇和甘油三酯含量。

1.3 膽汁酸結(jié)合實(shí)驗(yàn)

根據(jù)報(bào)道[4-5]的方法，進(jìn)行體外結(jié)合膽汁酸實(shí)驗(yàn)：分別稱取2.0g消膽胺、大豆蛋白、大豆多肽、大豆低聚肽加入0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液中，定容至100m L，調(diào)整pH至7.4，分別加入膽汁酸（牛磺膽酸、甘氨膽酸）至膽汁酸濃度為0.2mmol/L，于37℃靜置2h，在10000r/min離心5min，收集沉淀，采用Nyegaard公司的總膽汁酸測(cè)定試劑配方，用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定沉淀中的膽汁酸含量，膽汁酸結(jié)合率（%）=（沉淀中膽汁酸量/加入的膽汁酸量）×100。

1.4 血脂分析

根據(jù)報(bào)道[6]的方法，測(cè)定血清和肝臟中膽固醇和甘油三酯的含量。

根據(jù)報(bào)道[7]的方法，采用氣相色譜法測(cè)定糞便中類固醇的含量：準(zhǔn)確稱取0.2g干糞粉末，加入25m L具塞試管中，加入1m L蒸餾水混勻，再分別加入5m L蒸餾水（用于測(cè)定中性類固醇）、5m L酸液（即含1mol/L鹽酸的乙醇溶液，用于測(cè)定酸性類固醇），混勻后80℃水浴1h，冷卻并加入5m L石油醚振搖、萃取3m in，靜置3m in后取3m L萃取液加入10m L離心管，水浴加熱揮發(fā)至干，然后加入50μL三甲基硅醚，衍生化30m in，加入1m L乙酸乙酯溶解，進(jìn)樣1μL至島津GC-15進(jìn)行色譜分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，p＜0.05即為顯著性差異，p＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽汁酸結(jié)合能力

表1總結(jié)了不同實(shí)驗(yàn)樣品的膽汁酸結(jié)合能力，通過觀察這些物質(zhì)與兩種類型的膽汁酸，即?；悄懰帷⒏拾蹦懰岬慕Y(jié)合能力，由此可以看出，大豆低聚肽和大豆多肽的膽汁酸結(jié)合能力比較接近，但都明顯強(qiáng)于大豆蛋白的膽汁酸結(jié)合能力，這些物質(zhì)的膽汁酸結(jié)合能力都明顯弱于降膽固醇作用較強(qiáng)的藥物—消膽胺。

表1 各實(shí)驗(yàn)樣品的膽汁酸結(jié)合能力Table 1 The ability of bile acid binding of samples

2.2 對(duì)血清和肝臟中膽固醇和甘油三酯的影響

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了各實(shí)驗(yàn)組大鼠的血清和肝臟中膽固醇、甘油三酯的含量，結(jié)果見表2，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ（蛋白組）、Ⅲ（多肽組）、Ⅳ（低聚肽組1）、Ⅴ（低聚肽組2）、Ⅵ（低聚肽組3）的膽固醇和甘油三酯含量均顯著性低于對(duì)照組Ⅰ，實(shí)驗(yàn)組Ⅲ（多肽組）、Ⅳ（低聚肽組1）、Ⅴ（低聚肽組2）、Ⅵ（低聚肽組3）的膽固醇和甘油三酯含量又顯著性低于Ⅱ（蛋白組），實(shí)驗(yàn)組Ⅵ顯著性差異于實(shí)驗(yàn)組Ⅲ，且從實(shí)驗(yàn)組Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的結(jié)果來看，大豆低聚肽降低膽固醇的效果具有劑量依耐性。

表2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清和肝臟中膽固醇及甘油三酯的含量Table 2 The serum and liver cholesterol and triglyceride levels of experimental rats

2.3 對(duì)糞便中類固醇的影響

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)期收集的糞便干重及其中類固醇的含量，不同時(shí)期收集的糞便干重見表3，不同實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)期間排泄糞便中類固醇的日平均含量見圖1。

由表3可知，在實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組Ⅰ所采集的大鼠糞便干重基本上保持恒定，第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組所采集大鼠糞便干重除第Ⅱ、Ⅲ組在第1、2周與對(duì)照組Ⅰ相當(dāng)外，其余各組均大于對(duì)照組Ⅰ，且從第三周開始，糞便干重有明顯增加，這種增加的趨勢(shì)一直延續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，但后期增加的幅度逐漸減緩；第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組在各周所采集的大鼠糞便干重基本保持一致，但都明顯低于第Ⅵ組；低聚肽組的大鼠糞便干重有劑量依賴性。以上情況說明蛋白質(zhì)、多肽、低聚肽均有促進(jìn)大鼠排泄的作用，且相對(duì)大劑量的低聚肽促進(jìn)大鼠排泄的作用明顯強(qiáng)于蛋白質(zhì)、多肽和小劑量低聚肽。

表3 每周末收集大鼠糞便的平均干重（g/d）Table 3 The average dry weight of the rat feces of every weekend（g/d）

圖1 不同實(shí)驗(yàn)組大鼠糞便中類固醇的日平均含量Fig.1 The average daily fecal steroid contentofdifferent experimental rats

由圖1可知，相對(duì)于對(duì)照組Ⅰ，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ均能促進(jìn)大鼠類固醇的排泄，但對(duì)于中性類固醇和酸性類固醇的促進(jìn)作用不一致，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ能顯著促進(jìn)中性類固醇的排泄，實(shí)驗(yàn)組Ⅵ能極顯著促進(jìn)中性類固醇排泄，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ能顯著促進(jìn)酸性類固醇排泄，實(shí)驗(yàn)組Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ能極顯著促進(jìn)酸性類固醇排泄。

3 結(jié)論

膽固醇被認(rèn)為是心臟病和心血管疾病的主要元兇之一，每年都有數(shù)百萬人通過服用藥物來降低體內(nèi)的膽固醇水平，但由于藥物的副作用，開發(fā)能降低膽固醇的天然功能食品顯得十分必要。膽固醇的減少主要有兩個(gè)途徑，一是減少腸道吸收，二是增加膽固醇向體外的排泄。在我們的實(shí)驗(yàn)中，選用了大豆蛋白、大豆多肽和大豆低聚肽這三種功能成分來分別飼喂SD大鼠，然后測(cè)定實(shí)驗(yàn)前后大鼠血清和肝臟中膽固醇及甘油三酯的含量，通過于對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)這三種功能成分均能降低大鼠血清和肝臟中膽固醇及甘油三酯的含量，但降低的水平有差別，其中大豆低聚肽組顯示出最強(qiáng)的降低膽固醇的能力，大豆多肽次之，這為大豆多肽和大豆低聚肽的降低膽固醇功能比較提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在大豆低聚肽的劑量比較實(shí)驗(yàn)中，通過給SD大鼠飼喂不同劑量的大豆低聚肽，然后測(cè)定大鼠血清和肝臟中膽固醇及甘油三酯的含量，結(jié)果顯示，大豆低聚肽降低膽固醇含量的能力具有劑量依賴性，但到底飼喂多少大豆低聚肽最合適，這還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

為了印證各功能物質(zhì)降低膽固醇的功能，還進(jìn)行了各物質(zhì)體外結(jié)合膽汁酸的能力測(cè)定，收集并測(cè)定了大鼠糞便的干重及糞便中類固醇的含量，結(jié)果表明，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，每日糞便重量有所增加，且從第三周起增加尤為明顯，這說明大鼠對(duì)這些功能物質(zhì)可能有一個(gè)適應(yīng)期，同時(shí)糞便中類固醇的含量與各物質(zhì)體外結(jié)合膽汁酸的能力相一致，說明這些物質(zhì)能結(jié)合膽汁酸，并促進(jìn)大鼠的排便，特別是促進(jìn)大鼠類固醇的排泄。所有實(shí)驗(yàn)組中，高劑量的大豆低聚肽表現(xiàn)出了最強(qiáng)的降低膽固醇的功能。因此，開發(fā)大豆低聚肽類降膽固醇的功能食品，有著廣闊的前景。

[1]程天德，吳永堯.富硒大豆低聚肽的生理功能及應(yīng)用前景[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，23（2）：130-133.

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Cholesterol-lowering effect of soybean oligopeptides

CHENG Tian-de1，ZHANG Tao1，LIANG Yan-sheng2
（1.Qingyuan Polytechnic，Qingyuan 511510；
2.South China Agricultural University，Guangzhou 510642）

Ob jec tive：Cholesterol-lowering effect of soybean oligopep tides were stud ied.Method：In the experimentalenvironment，90 male SD rats at5 weeks old had been random ly divided into 6 groups，Ⅰ（control group），II（p rotein），III（polypep tides），IV（oligopep tides group 1），V（oligopep tides g roup 2） and VI（oligopep tides g roup 3），high cholesterol model of these rats had been constructed at first，then the high cholesterol had been used to each g roup，at the same time，soy p rotein had been used to g roup II，soybean polypep tide had been used to g roup III，different doses of soy oligopep tides had been given to g roup IV，V and VI，d rinking water w ith the same volume had been given to group I.The stools，b lood serum s and livers were collected and trig lyceride contents，fecal weight and the steroid content were determ ined after 6 weeks. Results：The cholesteroland trig lyceride content in serum and liver were reduced at different levels in g roup II，III，IV，V and VI，and the defecation and fecal steroid content of those groups were increased.Those results in group IV，V and VIwere dose dependently，and the cholesterol-lowering effec t was significantly in the group w ith the highest dose.Conc lusion：Cholesterol-lowering effects of soybean oligopep tides were stronger than soybean p rotein and polypep tide，and this effectwas dose-dependently.

soybean oligopep tides；cholesterol-lowering；soybean p rotein；soybean polypep tides

TS201.4

A

1002-0306（2012）22-0375-03

2012－06－05

程天德（1980-），男，碩士，講師，主要從事功能食品方面的研究。

清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級(jí)項(xiàng)目（KY090002）。