竹葉制備葉綠素銅鈉鹽的工藝優(yōu)化研究

紀平雄，區(qū)志豪，蔡英花，鐘楚茵，林 冰

（華南農(nóng)業(yè)大學理學院生物材料研究所，廣東廣州 510642）

竹葉制備葉綠素銅鈉鹽的工藝優(yōu)化研究

紀平雄，區(qū)志豪，蔡英花，鐘楚茵，林 冰

（華南農(nóng)業(yè)大學理學院生物材料研究所，廣東廣州 510642）

以竹葉為原料，石油醚與95%乙醇復合溶劑為提取溶劑提取葉綠素，葉綠素提取液直接經(jīng)過皂化、酸化、銅代、凈化和成鹽等步驟制備葉綠素銅鈉鹽。對影響產(chǎn)品得率和質(zhì)量指標的提取、銅代兩個關(guān)鍵工藝過程，利用L9（34）正交實驗進行工藝條件優(yōu)化。結(jié)果表明，竹葉葉綠素的最佳提取條件為復合溶劑中95%乙醇體積分數(shù)為15%、液固比8∶1（v∶w）、提取溫度55℃、提取時間2h；銅代過程最佳條件為乙醇體積分數(shù)85%、加銅量為理論值的2倍、反應(yīng)溫度60℃、pH2.5。葉綠素銅鈉鹽得率0.38%，檢驗結(jié)果主要指標符合食品添加劑國家標準。

竹葉，葉綠素，葉綠素銅鈉鹽，制備工藝，正交實驗

竹子是禾本科（Poaceae）竹亞科（Bambusoideae）多年生常綠植物，全世界約有60個屬1200多種，是生長速度最快的植物之一。中國是產(chǎn)竹最多的國家，共有22個屬200多種，遍布全國各地。竹葉中含有豐富的葉綠素、黃酮以及生物活性多糖等成分，但在竹子實際應(yīng)用研究中，往往忽略竹葉的綜合利用價值，而被當作廢物遺棄，造成極大的浪費[1]。據(jù)統(tǒng)計我國現(xiàn)有竹林面積35hm2，竹子約300億株，以每株竹子年再生竹葉2kg計，竹葉葉綠素含量在0.4%～0.5%計，每年在竹葉中損失掉的葉綠素估計在20M t以上[2]。此外竹葉中含脂質(zhì)類物質(zhì)少，易于精制，如用來制備葉綠素銅鈉鹽等衍生物，將是具有優(yōu)勢的原材料[3]。目前我國葉綠素及其衍生物的制備主要以蠶沙為原料，但隨著工業(yè)化和城市化進程的加快，使得養(yǎng)蠶業(yè)受到制約，影響了葉綠素及其衍生物生產(chǎn)的原料來源[4]。本文介紹了以復合溶劑為提取溶劑提取竹葉葉綠素，連續(xù)工藝法制備葉綠素銅鈉鹽，并以正交實驗法探討了關(guān)鍵步驟的最佳工藝條件。葉綠素銅鈉鹽比天然的葉綠素更穩(wěn)定，廣泛應(yīng)用于食品、日用和醫(yī)藥等行業(yè)[5]。具有加速傷口愈合、抗癌抗氧化、清除自由基等生理作用，是使用最多的功能性食品添加劑之一[6-7]。因此，本研究為今后竹葉資源實際開發(fā)提供一定的理論依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛竹（hyllostachys heterocycla CV．Pubescens）葉于夏季采之華南農(nóng)業(yè)大學校園內(nèi)，在室外散開晾曬半天，儲存于陰涼干燥處；95%乙醇、石油醚、濃鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅 均為分析純；其他使用的無機和有機試劑 均為國產(chǎn)分析純。

JJ300精密電子天平 常熟雙杰測試儀器廠；恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市江南儀器廠；UV2550紫外可見分光光度計 日本島津公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；RE-20000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 葉綠素含量的測定 葉綠素的測定參照喻薇等方法進行[8]。

1.2.2 葉綠素的提取和葉綠素銅鈉鹽的制備 稱取30g毛竹葉，加入石油醚和95%乙醇復合溶劑提取葉綠素2次，合并葉綠素提取液，再加入一定濃度的NaOH乙醇溶液，調(diào)節(jié)pH 12～13，60℃水浴皂化，靜置分層。下層皂化液加等體積的石油醚洗滌后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH2～3，然后加入質(zhì)量分數(shù)20%硫酸銅溶液，進行銅代反應(yīng)，反應(yīng)完成后加水使葉綠素銅酸析出。將葉綠素銅酸溶于丙酮中，加入NaOH乙醇液，調(diào)節(jié)pH11～12，濾取析出的晶體并干燥，得到墨綠色有金屬光澤的葉綠素銅鈉鹽[9]。

1.2.3 葉綠素提取和銅代過程的正交實驗 參考文獻[8]有關(guān)單因素實驗結(jié)果，采取L9（34）正交實驗法分別對葉綠素提取和銅代兩個關(guān)鍵過程的影響因素進行研究。葉綠素提取選擇所用復合溶劑體積與投料竹葉質(zhì)量之比（液固比）、復合溶劑中95%乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間作為實驗因素。正交實驗因素水平表見表1。

表1 L9（34）葉綠素提取的正交實驗因素水平表Table 1 The level of L9（34）orthogonal experiment factors of chlorophyll extracting

葉綠素銅代過程以加銅量、溶劑乙醇體積分數(shù)、反應(yīng)溫度及pH作為實驗因素，反應(yīng)時間均為1h。正交實驗因素水平表見表2。

表2 L9（34）葉綠素銅代的正交實驗因素水平表Table 2 The level of L9（34）orthogonal experiment factors of chlorophyll copper replacement

參照文獻[10]，葉綠素提取以葉綠素提取含量判定提取效率，葉綠素銅代以銅代率判定反應(yīng)的進行程度，得出最適工藝條件。

1.2.4 葉綠素銅鈉鹽質(zhì)量的檢驗 葉綠素銅鈉鹽主要質(zhì)量指標是產(chǎn)品的吸收光譜最大吸收波長、pH、消光比、特殊消光值、總銅和游離銅，均參照國家標準GB 3262-1982《食品添加劑葉綠素銅鈉鹽》規(guī)定方法進行檢驗[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素銅鈉鹽制備的連續(xù)工藝過程

從蠶沙和植物中提取葉綠素的研究報道多用丙酮或乙醇為提取溶劑，高效率的復合溶劑提取方法少有報道，以石油醚和乙醇作復合溶劑從原料中高效率提取葉綠素更為鮮見。石油醚對葉綠素和類脂物質(zhì)的溶解能力強，但對竹葉的滲透性差。由于曬干的竹葉仍然含有少量水分，有利于乙醇的滲透。乙醇對葉綠素有一定的溶解度，但對類脂物質(zhì)的溶解能力較之石油醚弱，而對某些極性雜質(zhì)溶解能力強。石油醚和乙醇兩者復合使用，可以起到互補作用，利用乙醇對竹葉的滲透性，可使葉綠素在復合溶劑液相和竹葉固相之間較快達到溶解平衡。得到的葉綠素提取液中類脂和極性雜質(zhì)都較使用單一溶劑大大減少，有利于后續(xù)工藝步驟。

常見的葉綠素銅鈉鹽的制備過程，都是葉綠素提取液回收溶劑后得到油狀的葉綠素，再溶解于石油醚，加入氫氧化鈉乙醇溶液皂化。使用石油醚和乙醇復合溶劑則無需先回收溶劑，可直接加入氫氧化鈉乙醇液皂化，此時乙醇濃度仍可保持皂化步驟所要求的75%～ 80%濃度，確保皂化完全。這樣就有效地減少溶劑回收過程的能量消耗，縮短了操作時間，降低了生產(chǎn)成本。此外，石油醚和乙醇復合溶劑提取葉綠素，葉綠素提取液雜質(zhì)大為減少，皂化后得到的皂化液雜質(zhì)也少。隨后的酸化和銅代步驟的條件控制也變得容易，反應(yīng)過程條件控制的穩(wěn)定性也提高，最終所得到的葉綠素銅鈉鹽產(chǎn)品的質(zhì)量指標也呈現(xiàn)很高的重現(xiàn)性。

2.2 葉綠素提取和銅代過程的正交實驗優(yōu)化

表3 葉綠素提取的L9（34）正交正交實驗設(shè)計和結(jié)果Table 3 Results of L9（34）orthogonal experimentof chlorophyll extracting

從表3中極差（R）可知C＞B＞A＞D，說明作為提取溶劑的復合溶劑95%乙醇在石油醚中的體積分數(shù)和提取時間是影響竹葉提取葉綠素的關(guān)鍵因素，提取劑的用量即復合溶劑對竹葉的液固比的影響也是比較大的，提取溫度的影響最小。由表3中的各實驗因素的平均值可以得出，竹葉提取葉綠體色素的效率最高的組合條件是A3B3C2D1或A3B3C3D1，但考慮到葉綠素在加熱條件下時間長容易氧化降解，以及實際生產(chǎn)中時間延長帶來的能量消耗的增加，因此選擇A3B3C2D1作為最佳提取條件。即以復合溶劑體積與投料竹葉質(zhì)量之比液固比8∶1（v∶w），乙醇體積分數(shù)15%的乙醇石油醚復合溶劑作提取溶劑，在50℃溫度下提取2h。連續(xù)提取2次，測定提取液葉綠素，相當竹葉葉綠素提取含量4.98mg/g。這是因為在復合溶劑中的乙醇較之使用丙酮或乙醇單一溶劑所占體積分數(shù)少，而葉綠素的提取取決于乙醇對竹葉的滲透，因而時間的影響在開始顯得尤為顯著，2h后達到滲透平衡后趨于穩(wěn)定。并且復合溶劑中乙醇體積分數(shù)少于15%時，就會使竹葉體乙醇濃度達不到75%的要求，葉綠素就難以被提取出來。此外，竹葉比重小，所占容積大，提取時必須保證溶劑浸過竹葉表面，否則造成溶劑與竹葉不能充分接觸，導致葉綠素難以提取完全。相比之下，溫度在50～60℃之間，區(qū)別不太大[12-13]。

表4 葉綠素銅代的L9（34）正交正交實驗設(shè)計和結(jié)果Table 4 Results of L9（34）orthogonal experimentof chlorophyll copper replacement

竹葉制備葉綠素銅鈉鹽工藝過程中的銅代步驟，銅代率的大小是決定其主要質(zhì)量指標吸收波長、消光比、特殊消光值、總銅、游離銅等是否合符規(guī)定標準的關(guān)鍵，因而必須嚴格地控制好影響銅代步驟的主要條件。從表4的數(shù)據(jù)極差（R）可以得出A＞D＞B＞C，加銅量和pH的控制對銅代率的影響最為顯著。這是由于銅代是在酸性條件下進行，皂化步驟得到的葉綠素鎂鈉此時轉(zhuǎn)化為脫鎂葉綠酸，脫鎂葉綠酸在合適的pH條件下溶解于乙醇。在pH偏高時脫鎂葉綠酸和銅代生成的葉綠素銅酸析出浮于表面，硫酸銅則析出沉淀。在pH偏低時銅代率偏低且后續(xù)凈化步驟操作困難。再者銅代液中夾有其他干擾雜質(zhì)且脫鎂葉綠酸濃度低，因而銅代液中必須有足夠的硫酸銅濃度，才能確保銅代完全。但硫酸銅濃度偏高也不行，偏高往往使游離銅指標偏高；溶劑濃度的影響雖然不及加銅量和pH，但控制不好也對銅代率有較大影響，因為硫酸銅溶于水而不溶于90%以上高濃度乙醇溶劑，85%左右乙醇濃度才能保證反應(yīng)物在均相條件下進行；至于反應(yīng)溫度，隨著脫鎂葉綠酸不斷轉(zhuǎn)化為葉綠素銅酸，由原來對光和熱的不穩(wěn)定變得越來越穩(wěn)定，對葉綠素銅鈉鹽產(chǎn)品質(zhì)量指標影響不大?？刂?0℃左右除了維持銅代液的均相，提高反應(yīng)速度，防止溫度過高，主要還是避免乙醇揮發(fā)，保持銅代液中乙醇濃度的穩(wěn)定。最優(yōu)組合為A2B2C2D2即加銅量按理論值的2.0倍、乙醇體積分數(shù)85%、反應(yīng)溫度60℃、pH2.5為葉綠素銅鈉鹽生產(chǎn)銅代過程的最適工藝條件[14]，最優(yōu)工藝條件制備葉綠素銅鈉鹽，銅代率為58.2%～59%。

2.3 葉綠素銅鈉鹽產(chǎn)品檢驗結(jié)果

按最優(yōu)工藝條件制備葉綠素銅鈉鹽3次，所得產(chǎn)品主要指標檢驗結(jié)果見表5。

由表5可知，葉綠素銅鈉鹽的各項主要指標均符合國家規(guī)定標準。用UV2550紫外可見分光光度計，在300～800nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，可見葉綠素銅鈉鹽在405、630nm處有兩個重現(xiàn)性極高的最大吸收峰，且在405nm處的波峰最高。查文獻得葉綠素銅鈉鹽有兩個最大峰范圍404～406nm和629～631nm，實驗發(fā)現(xiàn)，這與銅代率有關(guān)系，銅代率由銅絡(luò)合量即實際銅代質(zhì)量決定，偏于規(guī)定值4～6高側(cè)則重現(xiàn)性在405、630nm高。和文獻所記載葉綠素的紫外吸收比較，葉綠素銅鈉鹽的吸收峰位置明顯藍移，且葉綠素銅鈉鹽在630nm的吸收與葉綠素在660nm附近的吸收相比大大減少，這就是葉綠素銅鈉鹽的消光比比葉綠素大得多的原因[4]。此外，銅代率越低，產(chǎn)品中所含的脫鎂葉綠素類化合物就越多，而脫鎂葉綠素類化合物呈灰褐色，這樣就直接影響到產(chǎn)品的色澤度，甚至使其呈現(xiàn)枯葉黃色，從而影響其作為天然著色劑的產(chǎn)品質(zhì)量，高銅代率的葉綠素銅鈉鹽色彩及穩(wěn)定性更好。檢測結(jié)果表明，所制備的葉綠素銅鈉鹽純度是高的[15]。

3 結(jié)論

以竹葉為原料，石油醚與95%乙醇復合溶劑為提取溶劑提取葉綠素，葉綠素提取液直接經(jīng)過皂化、酸化、銅代、凈化和成鹽等步驟制備葉綠素銅鈉鹽。對影響產(chǎn)品得率和質(zhì)量指標的提取、銅代兩個關(guān)鍵工藝過程，利用L9（34）正交實驗進行工藝條件優(yōu)化。結(jié)果表明，竹葉葉綠素的最佳提取條件為復合溶劑中95%乙醇體積分數(shù)15%、液固比8∶1（v∶w）、提取溫度50℃、提取時間2h；置銅過程最佳條件為乙醇體積分數(shù)85%、加銅量為理論值的2.0倍、反應(yīng)溫度60℃、pH 2.5。以最佳工藝條件制備的葉綠素銅鈉鹽得率0.38%，檢驗結(jié)果主要指標符合食品添加劑國家標準。與常見的回收溶劑得到的葉綠素糊，再溶于石油醚后加氫氧化鈉皂化的方法相比，連續(xù)工藝法簡化了工藝，節(jié)省了操作時間和材料消耗。

表5 葉綠素銅鈉鹽產(chǎn)品各項指標測定結(jié)果Table 5 Main quality index of sodium copper chlorophyllin

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Research of optim ization of preparation technology of sodium copper chlorophyllin from bamboo leaves

JIPing-xiong，OU Zhi-hao，CAIYing-hua，ZHONG Chu-yin，LIN Bing
（Institute of Biomaterial，College of Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Bamboo leaves were used as raw material，and the com posite solvent of petroleum ether and 95% ethanolwas used as extraction solventofchlorophyll.Chlorophyllextracted d irectly after the step ofsaponification，acid ification，copper rep lacement，purification，salt formation and so on were p repared as the sodium copper chlorophyllin.There were two key p rocesses，one was the extraction p rocessesac tion which affected the p roduc t yield and the other was copper rep lacement p rocessesaction which affected the quality ind icators respectively.The p rocess cond itions were op tim ized by L9（34）orthogonal test.The result showed op timum extraction conditions of the bamboo leaves chlorophyllwere 15%of the volume fraction of 95%ethanol in the com posite solvent，taking the composite solvent eight times the volume of bamboo leaves as extractant，ratio of liquid to solid 8∶1（v∶w），extraction temperature 55℃，extraction time 2h.Best p rocess conditions of copper rep lacement were the ethanol volume fraction of 85%，the increase of copper content was two times of the theoretical value，reac tion tem perature 60℃，pH2.5.The p roduct yield of sodium copper chlorophyllin was 0.38%.Main indicators of the test resultwere in accordance w ith the national standards of food add itives.

bamboo leaves；chlorophyll；sod ium copper chlorophyllin；p reparation technology；orthogonal test

TS201.1

B

1002-0306（2012）22-0323-04

2012－06－11

紀平雄（1956-），男，副教授，研究方向：應(yīng)用化學與生物資源利用。

華南農(nóng)業(yè)大學“211工程”三期重點建設(shè)項目（2009B010100001）。