富鍺木耳菌絲體主要化學(xué)成分分析

朱蘊(yùn)蘭

（徐州工程學(xué)院，江蘇徐州 221111）

富鍺木耳菌絲體主要化學(xué)成分分析

朱蘊(yùn)蘭

（徐州工程學(xué)院，江蘇徐州 221111）

以木耳為研究材料，采用深層液體培養(yǎng)的方法獲得富鍺木耳菌絲體。測(cè)定了富鍺木耳菌絲體的主要化學(xué)成分含量。結(jié)果表明，木耳液體深層培養(yǎng)在鍺濃度400μg/mL時(shí)，菌絲體生物量、胞內(nèi)多糖、蛋白質(zhì)、鳥苷、胞苷含量均達(dá)到最高，分別為10.11、106.80、117.52、10.59、11.65mg/g，分別比空白對(duì)照提高了10.86%、16.56%、15.27%、49.58%、29.36%。富鍺木耳菌絲體氨基酸含量在鍺濃度為600μg/mL時(shí)含量最高為82.18mg/g，比空白對(duì)照提高了11.58%。菌絲體有機(jī)鍺含量在鍺濃度為800μg/mL時(shí)最高，達(dá)到8.67mg/g，比空白對(duì)照增加了57.8倍。在鍺濃度實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)木耳菌絲體中有機(jī)鍺含量則隨著鍺濃度的升高而增加。木耳菌絲體中胞內(nèi)多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、鳥苷、胞苷等含量均隨著鍺濃度的上升呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，鍺在低濃度時(shí)對(duì)上述生物學(xué)指標(biāo)有促進(jìn)作用，在高濃度時(shí)對(duì)其有抑制作用。

木耳，深層液體培養(yǎng)，鍺，化學(xué)成分

木耳（Auricularia auricula），別名黑木耳、光木耳，屬擔(dān)子菌綱，木耳目，木耳科，是人們主要的食用菌之一，在各國(guó)各地都有分布。主要在櫟、楊、榕、槐等一百二十多種闊葉樹的腐木上，單生或群生[1]。木耳是一種藥食兼用的真菌，既有營(yíng)養(yǎng)，味道又鮮美，而且蛋白質(zhì)、維生素、鈣、粗纖維、鐵等物質(zhì)的含量都十分豐富，此外還含有多種微量元素和對(duì)人體有益的氨基酸，被稱做“素中之葷”。木耳具有益氣、潤(rùn)肺、補(bǔ)腦以及促進(jìn)血液循環(huán)等功能，可以抗血栓、抗凝血、軟化血管，防止心肌梗塞以及預(yù)防和治療高脂血癥、動(dòng)脈硬化、冠心病，減少心血管疾病的發(fā)病率。木耳還可以有助于體內(nèi)代謝廢物的排除，促進(jìn)胃和腸道的蠕動(dòng)，化解膽結(jié)石和腎結(jié)石，預(yù)防便秘和結(jié)腸癌的發(fā)生，同時(shí)具有防止肥胖和增強(qiáng)機(jī)體免疫的能力。木耳對(duì)脂質(zhì)過氧化有抑制作用，可以延緩衰老，并預(yù)防和治療多種老年疾病[2-5]。鍺屬于稀有元素，在土壤、植物中的含量一般較低，但有機(jī)鍺具有增加體內(nèi)含氧量、清除自由基、抗炎、滋補(bǔ)、強(qiáng)身、抗癌、抗突變和增強(qiáng)免疫的作用[6-8]。已有研究證實(shí)食用菌菌絲體對(duì)鍺富集能力較強(qiáng)，可以使無(wú)機(jī)鍺轉(zhuǎn)化為菌絲體中的有機(jī)鍺，降低毒性，增加有機(jī)鍺的利用率，提高鍺的生物效應(yīng)，同時(shí)能更好地改善食用菌的品質(zhì)。有關(guān)食用菌對(duì)鍺富集的研究已有一些[9-10]報(bào)道，但木耳對(duì)鍺的富集研究尚未見報(bào)道，本研究試圖通過木耳的生物轉(zhuǎn)化作用將無(wú)機(jī)鍺轉(zhuǎn)化為有機(jī)鍺，并研究木耳在不同鍺濃度環(huán)境下，主要化學(xué)成分含量的變化，為進(jìn)一步開發(fā)木耳產(chǎn)品，提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木耳（Auricularia auricula） 江蘇徐州豐縣大山河食用菌生產(chǎn)基地提供；斜面培養(yǎng)基 葡萄糖4%、酵母膏1%、蛋白胨1%、瓊脂2%、去離子水；液體種子培養(yǎng)基 葡萄糖3%、蛋白胨1%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.2%、氧化鍺350μg/m L、去離子水；發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖2%、酵母膏0.2%、硫酸鎂0.1%、磷酸二氫鉀0.2%、去離子水；鍺標(biāo)準(zhǔn)液 國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院；氧化鍺 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HYG-Ⅱ型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海欣蕊自動(dòng)化有限公司；GPH-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GZX-DH 40X45-BC型電熱恒溫干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；FA-210N型電子天平 上海精密儀器有限公司；YXQ-SG41-280型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海醫(yī)用核子設(shè)備廠；82-1型低速離心機(jī) 常州國(guó)華電器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工有限公司；XT-9900型智能微波消解儀 中國(guó)上海新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司；XT-9700型冷卻機(jī) 中國(guó)上海新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司；TAS-990型原子吸收分光光度計(jì)、CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀、TU-1810型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 木耳富鍺培養(yǎng) 活化后的菌種→斜面培養(yǎng) （23℃，5～7d）→搖瓶種子培養(yǎng)（250mL三角瓶裝樣量100mL，23℃，120r/min，5～7d）→富鍺擴(kuò)大培養(yǎng)（10%的接種量接入不同鍺含量的發(fā)酵培養(yǎng)基，23℃，120r/min，5～7d）。

1.2.2 木耳菌絲體干粉的制作 將發(fā)酵液經(jīng)減壓抽濾得到菌絲體，然后將菌絲體置于50℃干燥箱中干燥至恒重，研磨成粉末，裝入小塑料袋，放入干燥器內(nèi)備用。

1.2.3 生物量的測(cè)定 將發(fā)酵液抽濾得到菌絲體，經(jīng)干燥至恒重，稱量，即為生物量。

1.2.4 多糖的提取及測(cè)定方法 采用水提醇析的方法提取多糖[11]，取0.15g菌絲粉加水50m L于80℃水浴鍋中水浴1h，抽濾取濾液；如此重復(fù)三次，將三次抽提液合并，濃縮到約20m L，加3倍體積的95%乙醇，于冰箱中靜置醇析過夜后取出，4800r/m in離心10m in，沉淀物加水定容到250m L容量瓶中待用[12]。多糖的測(cè)定采用苯酚—硫酸法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程測(cè)定樣品多糖含量。多糖含量的計(jì)算方法：

多糖含量（%）=（測(cè)得多糖溶液的多糖含量×稀釋倍數(shù)×多糖溶液體積/樣品重量）×100

1.2.5 有機(jī)鍺含量的測(cè)定 a.菌絲粉用透析袋透析2d，每天換2～3次水，將其中的無(wú)機(jī)鍺透析掉[13]。b.微波消解（微波消解階段設(shè)置：功率為80%，壓力為10kPa，時(shí)間300s），得到消解液于冷卻機(jī)中趕酸30m in，定容到10m L容量瓶中，待測(cè)[14]。c.鍺含量測(cè)定用火焰原子吸收分光光度計(jì)（波長(zhǎng)265.2nm，工作電流5mA，燃?xì)饬髁?000m L/m in，燃燒高度5.0mm，負(fù)高壓350V，光譜帶寬0.4nm）測(cè)定其吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算該樣品中有機(jī)鍺的含量[15]。d.鍺標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制于10m L容量瓶?jī)?nèi)準(zhǔn)確取1m L鍺標(biāo)準(zhǔn)溶液，加1%硝酸定容。分別取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0m L于1m L容量瓶中，加5μg基體改進(jìn)劑硝酸鎳[16]，用1%硝酸定容，用上述方法測(cè)定，并求回歸方程。

1.2.6 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用考馬斯亮蘭方法測(cè)定，以純牛血清蛋白為對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6m L蛋白溶液，用0.15mol/L NaCl補(bǔ)充至1.0m L；加入5.0m L考馬斯亮藍(lán)試劑，作用5～30m in后于595nm下測(cè)吸光度，以1.0m L水按同樣操作為空白，以吸光度值為縱坐標(biāo)，多蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)[17]，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求回歸方程。樣品測(cè)定的按照上述操作步驟操作，測(cè)出樣品的A595nm的吸光度值，然后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算出樣品中的蛋白質(zhì)含量。

1.2.7 氨基酸含量測(cè)定 a.制備氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.1g在105℃干燥箱中干燥至恒重的L-丙氨酸，用純水溶解并且定容到100m L，即得到1g/L的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液。b.茚三酮試劑的制備：于100m L容量瓶中準(zhǔn)確稱取2g水合茚三酮，用少量95%乙醇溶解并定容至刻度，制得20g/L的茚三酮水溶液。c.繪制L-丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別吸取1g/L的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0m L于容量瓶中，再用緩沖溶液定容至50m L，得到濃度為60、70、80、90、100mg/L的氨基酸溶液。然后于5支試管中分別準(zhǔn)確吸取上述試液5m L，取5m L純水于對(duì)照試管中，再分別加入1.0m L茚三酮試劑置于各支試管中，加塞并搖勻。將6支試管一起放入沸水浴（92℃）中，25m in后取出，溶液變?yōu)樗{(lán)紫色，冷卻至室溫，在569nm下測(cè)其吸光度值[18]，并求標(biāo)準(zhǔn)回歸方程。d.樣品測(cè)定：稱取干燥粉碎過篩好的木耳菌絲體0.1g，加入50m L蒸餾水，在60℃下超聲波（600W，55kHz）提取110s，重復(fù)抽提3次，合并抽提液，用純水定容至100m L，再于試管中取5.0m L提取液，將木耳提取液用純水稀釋至25m L，定容，搖勻。按1.2.5中c.方法進(jìn)行操作，測(cè)其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算總氨基酸含量[19]。

1.2.8 鳥苷、胞苷的提取 精確稱取0.3g木耳菌絲體3份，分別溶于50m L蒸餾水，選用超聲波-微波協(xié)同萃取儀中微波和超聲波協(xié)同作用（微波時(shí)間110s，功率200W，超聲波頻率40kHz，功率50W）重復(fù)提取3次，提取后離心過濾，稀釋定容至250m L[20]。

1.2.9 鳥苷、胞苷的測(cè)定 精密稱取10mg鳥苷、胞苷標(biāo)準(zhǔn)品，用純水溶解，稀釋定容至100m L，制備成100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。利用100mg/L的鳥苷、胞苷母液，分別配制0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/L的鳥苷、胞苷溶液，紫外分光光度計(jì)全波段掃描1.0mg/L的鳥苷、胞苷標(biāo)準(zhǔn)品，分別在215、229nm波長(zhǎng)處測(cè)定鳥苷和胞苷的最大吸收峰。以鳥苷、胞苷質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)X，吸光度為縱坐標(biāo)Y，制作鳥苷、胞苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，將提取好的樣品按上述方法測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算鳥苷和胞苷的質(zhì)量濃度。鳥苷、胞苷含量計(jì)算：

鳥苷、胞苷含量（mg/g）＝鳥苷、胞苷質(zhì)量濃度×稀釋體積/木耳菌絲體質(zhì)量

2 結(jié)果與分析

2.1 鍺濃度對(duì)木耳菌絲體生物量的影響

在不同鍺濃度培養(yǎng)條件下木耳菌絲體的生物量如圖1所示。

圖1 不同鍺濃度下木耳菌絲體的生物量Fig.1 The biomass of Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由圖1結(jié)合方差分析，鍺濃度對(duì)木耳菌絲體生物量存在極顯著影響（p＜0.01），當(dāng)濃度為400μg/m L時(shí)菌絲體生物量最多，達(dá)10.11mg/m L，比空白對(duì)照提高10.86%。

2.2 鍺濃度對(duì)木耳菌絲體胞內(nèi)多糖含量的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到多糖含量標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：y= 0.0179x+0.085，R2=0.9545，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算得到不同鍺濃度培養(yǎng)條件下木耳菌絲體胞內(nèi)多糖含量如圖2所示。

圖2 不同鍺濃度下木耳菌絲體胞內(nèi)多糖含量Fig.2 The intracellular polysaccharide contentof Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由圖2結(jié)合方差分析，鍺濃度對(duì)木耳菌絲體胞內(nèi)多糖含量存在極顯著影響（p＜0.01），當(dāng)鍺濃度為400μg/m L時(shí)，菌絲體中胞內(nèi)多糖含量最多，達(dá)106.80mg/g，比空白對(duì)照提高16.56%。

2.3 鍺濃度對(duì)木耳菌絲體有機(jī)鍺含量的影響

由實(shí)驗(yàn)得到鍺含量標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：y=0.065x+ 0.0037，R2=0.9826，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算得到不同鍺濃度培養(yǎng)條件下木耳菌絲體中有機(jī)鍺含量如圖3所示。

由圖3結(jié)合方差分析，鍺濃度對(duì)木耳菌絲體中有機(jī)鍺含量存在顯著影響（p＜0.05），當(dāng)鍺濃度在800μg/m L時(shí)，菌絲體的有機(jī)鍺含量最多，達(dá)到8.67mg/g，比空白對(duì)照增加57.8倍。在本實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)基中鍺濃度越高，木耳菌絲體中有機(jī)鍺含量越多。

圖3 不同鍺濃度下木耳菌絲體中有機(jī)鍺含量Fig.3 The organic Ge contentof Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

2.4 鍺濃度對(duì)木耳菌絲體蛋白質(zhì)含量的影響

由實(shí)驗(yàn)得到木耳菌絲體蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：y=0.0078x+0.019，R2=0.9932，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算得不同鍺濃度培養(yǎng)條件下木耳菌絲體中蛋白質(zhì)含量如圖4所示。

圖4 不同鍺濃度下木耳菌絲體蛋白質(zhì)含量Fig.4 The protein contentof Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由圖4結(jié)合方差分析，鍺濃度對(duì)木耳菌絲體中蛋白質(zhì)含量存在極顯著影響（p＜0.01），當(dāng)鍺濃度為400μg/m L時(shí)菌絲體中蛋白質(zhì)含量最多，達(dá)到117.52mg/g，比空白對(duì)照提高15.27%。

2.5 鍺濃度對(duì)木耳菌絲體中氨基酸含量的影響

由實(shí)驗(yàn)得氨基酸含量標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：y= 0.1522x-0.0318，R2=0.9994，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算得到不同鍺濃度培養(yǎng)條件下木耳菌絲體中氨基酸含量如圖5所示。

圖5 不同鍺濃度下木耳菌絲體氨基酸含量Fig.5 The amino acids contentof Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由圖5結(jié)合方差分析，鍺濃度對(duì)木耳菌絲體中氨基酸含量存在極顯著影響（p＜0.01），當(dāng)鍺濃度為600μg/m L時(shí)，木耳菌絲體中氨基酸的含量最多，達(dá)到82.18mg/g，比空白對(duì)照提高了11.58%。

2.6 鍺濃度對(duì)木耳菌絲體鳥苷含量的影響

由實(shí)驗(yàn)得到鳥苷標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：y=0.0018x+ 0.0038，R2=0.9878，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程得出不同鍺濃度培養(yǎng)條件下木耳菌絲體中鳥苷含量如圖6所示。

圖6 不同鍺濃度下木耳菌絲體鳥苷含量Fig.6 The guanosine content of Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由圖6結(jié)合方差分析，鍺濃度對(duì)木耳菌絲體中鳥苷含量存在極顯著影響（p＜0.01），當(dāng)鍺濃度為400μg/m L時(shí)，菌絲體中鳥苷含量最多，達(dá)到10.59mg/g，比空白對(duì)照提高了49.58%。

2.7 鍺濃度對(duì)木耳菌絲體胞苷含量的影響

由實(shí)驗(yàn)得出胞苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.0013x+0.0015，R2=0.9826，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出不同鍺濃度培養(yǎng)條件下木耳菌絲體中胞苷含量如圖7所示。

圖7 不同鍺濃度下木耳菌絲體胞苷含量Fig.7 The cytidine contentof Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由圖7結(jié)合方差分析，鍺濃度對(duì)木耳菌絲體中胞苷含量存在顯著影響（p＜0.05），當(dāng)鍺濃度為400μg/m L時(shí)，菌絲體中胞苷含量最多，達(dá)到11.65mg/g，比空白對(duì)照提高了29.36%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在鍺濃度較低情況下，鍺可以促進(jìn)木耳菌絲體的形成，提高菌絲體生物量，增加木耳菌絲體胞內(nèi)多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、鳥苷和胞苷含量；當(dāng)鍺濃度較高時(shí)，對(duì)木耳菌絲體的形成有一定的抑制作用，使木耳菌絲體生物量、胞內(nèi)多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、鳥苷和胞苷含量減少。鍺是稀有元素，機(jī)體需求量甚微，在較低濃度時(shí)可能由于有機(jī)鍺參與了菌絲體的代謝活動(dòng)，構(gòu)成某些酶的組成部分，通過增加菌絲體的含氧量和清除一定的自由基，使菌絲體代謝活動(dòng)增加，菌絲體的形成能力增強(qiáng)，從而提高了菌絲體生物量。有研究表明[21]，食藥用菌中的鍺可能是通過與多糖、蛋白質(zhì)等相結(jié)合的形態(tài)存在，因此，通過食用菌的生物轉(zhuǎn)化作用，使無(wú)機(jī)鍺轉(zhuǎn)化為有機(jī)鍺，并增加了菌絲體的蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)的含量。當(dāng)鍺濃度過高時(shí)，由于菌絲體對(duì)鍺的需要量很微少，加之其具有一定的毒性使菌絲體的代謝受阻，菌絲體的形成能力減弱，降低了菌絲體的生物量、胞內(nèi)多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、鳥苷和胞苷等成分的含量。

在本實(shí)驗(yàn)鍺濃度范圍內(nèi)，木耳菌絲體中有機(jī)鍺含量隨著培養(yǎng)基中鍺濃度的升高而增加。這可能是由于培養(yǎng)基中鍺濃度的增加，使其轉(zhuǎn)化為有機(jī)鍺的底物含量增加了，提高了轉(zhuǎn)化效率所致。

4 結(jié)論

綜上所述，在木耳深層液體富鍺培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中鍺濃度對(duì)木耳菌絲體主要化學(xué)成分含量有顯著影響，鍺濃度在適當(dāng)范圍內(nèi)可以增加木耳菌絲體生物量，胞內(nèi)多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)鍺、鳥苷、胞苷等幾種主要成分含量，當(dāng)鍺濃度過高時(shí)對(duì)上述主要成分含量的形成有抑制作用。在鍺濃度實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)木耳菌絲體中有機(jī)鍺含量隨著鍺濃度的升高而增加。

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Main chem ical com positions analysis of Auricularia auricula germanium riched

ZHU Yun-lan
（Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221111，China）

Auricularia auricular was used as thematerials and gotm ycelia Ge riched by using of submerged liquid cultivation in d ifferent concentration of Ge，through the determ ination ofm ycelia biological ind icators to find the effects of Ge concentration to the main com position of the Auricularia auricula.The result showed that as the Ge concentration was at 400μg/m L in the culuture med ium，m ycelia biomass，the contents of polysaccharide，p rotein，guanosine and cytid ine reached the peak，10.11，106.80，117.52，10.59，11.65mg/g，respectively.As com pared w ith the control b lank，the m ycelia biomass，the contents of polysaccharide，p rotein，guanosine and cytid ine increased by 10.86%，16.56%，15.27%，49.58%，29.36%，respectively.When Ge concentration was 600μg/m L，the contentof am ino acids reached the highest up to 82.18mg/g，when increased 11.58%com pared w ith the control b lank.When organic germanium concentration was 800μg/m L，organic germanium content reached 8.67mg/g，and it was 57.8 times of the correspond ing control.The content of organic germanium increased w ith the rise of the Ge concentration inc reases in the range of this testofGe concentration.The content of intracellular polysaccharide，am ino acid，p rotein，guanosine and cytidine of Auricularia auricular allalong w ith the rise of the Ge concentration on first increased and then decreased tendency.Ge could im p rove the content above the index when Ge concentration was low，and could inhibition the contentas Ge concentration was high.

Auricularia auricula；submerged liquid culture；germanium；chem ical compositions

TS201.3

A

1002-0306（2012）22-0234-05

2012－08－29

朱蘊(yùn)蘭（1968-），女，講師，研究方向：應(yīng)用微生物。