重組過(guò)氧化物酶A4-Prx酶學(xué)特性及其降解DDGS中ZEN的研究

吳 暉，肖俊梅，陳 藝，余元善，陳深亮，唐語(yǔ)謙，*

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640；

2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東廣州 510610）

重組過(guò)氧化物酶A4-Prx酶學(xué)特性及其降解DDGS中ZEN的研究

吳 暉1，肖俊梅1，陳 藝1，余元善2，陳深亮1，唐語(yǔ)謙1，*

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640；

2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東廣州 510610）

初步研究了一種重組過(guò)氧化物酶Acinetobacter sp.SM04（A4-Prx）的酶學(xué)特性，并先對(duì)pH、溫度和H2O2濃度對(duì)過(guò)氧化物酶A4-Prx活性的影響進(jìn)行單因素優(yōu)化，然后采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)A4-Prx降解玉米酒糟中玉米赤霉烯酮的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，重組過(guò)氧化物酶A4-Prx不含有血紅素，其過(guò)氧化物酶活性的最適pH、溫度和H2O2濃度分別為pH8.5、75℃、25mmol/L；A4-Prx降解DDGS中ZEN的最佳反應(yīng)條件為：H2O2濃度40mmol/L，料液比1∶2（g/mL），溫度70℃，時(shí)間9h，且在該條件下ZEN降解率為99.2%±0.2%。

過(guò)氧化物酶，酶學(xué)特性，ZEN，DDGS，生物降解，正交實(shí)驗(yàn)

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN，ZEA），又名F-2雌性毒素，是世界上污染范圍最廣的一種鐮刀霉毒素，其性質(zhì)穩(wěn)定，難降解[1-3]。玉米及其副產(chǎn)品極易受ZEN污染[4-5]。王金榮等對(duì)玉米酒糟DDGS（dried distillers’grains and soluble）多個(gè)樣品調(diào)查結(jié)果顯示，ZEN的陽(yáng)性檢出率均為100%，ZEN含量范圍為4.79～1219.90μg/kg，超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（玉米中ZEN含量≤60μg/kg）5～20倍以上，其對(duì)DDGS為飼料的禽畜危害深遠(yuǎn)[6-8]。生物轉(zhuǎn)化脫毒ZEN技術(shù)能避免物理和化學(xué)方法的去毒效果有限、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失大、成本高和有害物質(zhì)殘留等缺點(diǎn)，已成為研究熱點(diǎn)和主要趨勢(shì)[9-10]。日本Takahashi-Ando等對(duì)粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）的研究較為全面，分離出的內(nèi)酯水解酶zhd101可破壞ZEN結(jié)構(gòu)，使其轉(zhuǎn)化為雌激素毒性較弱的化合物，且ZEN的降解率在80%～90%之間[11-12]。大腸桿菌和釀酒酵母表達(dá)的重組zhd101表現(xiàn)出了內(nèi)酯水解酶的能力，對(duì)ZEN的降解率可達(dá)75%[13-14]，具有zhd101的轉(zhuǎn)基因玉米也具備降解ZEN的能力[15]。此外，奧地利Molnar從白蟻后腸中分離出了一種新酵母菌—毛孢子菌屬Trichosporon mycotoxinivorans，它的培養(yǎng)物能將ZEN降解為二氧化碳和其他弱紫外吸收的代謝物，從而降低其毒性[16]；Abdullah從玉米地里分離的假單胞菌ZEA-1可利用ZEN為唯一碳源，并且在12h內(nèi)可將ZEN減少一半[17-18]，編碼此ZEN降解酶的基因在大腸桿菌中也獲得了活性表達(dá)[18]。本課題組成員從Acinetobacter sp.SM 04培養(yǎng)物上清液中分離到一種有降解ZEN功能的過(guò)氧化物酶[19]，并且克隆了其基因在大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中獲得了活性表達(dá)[20]。本文在此基礎(chǔ)上，對(duì)此重組過(guò)氧化物酶A4-Prx的酶學(xué)特性進(jìn)行研究，并且探索了A4-Prx在DDGS中對(duì)ZEN降解的最優(yōu)條件，從而為綜合開(kāi)發(fā)利用DDGS提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

重組大腸桿菌E.coli BL21/pET31b/A4-Prx 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；DDGS樣品（ZEN含量約2000μg/kg）

廣州郊區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)收購(gòu)；氨芐青霉素和IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷） 廣州翔博生物科技有限公司；30%H2O2水溶液 上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；酵母浸膏、胰蛋白胨、氯化鈉 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；甲醇、乙腈 天津啟輪化學(xué)科技有限公司，色譜純。

Waters高效液相色譜儀、2745熒光檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司；恒溫氣浴、水浴搖床 江蘇蘇昆儀器有限公司；N2蒸發(fā)儀 美國(guó)Organomation Associates公司；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海圣葉科技儀器有限公司；PuriToxSR TC-M 160真菌毒素多功能凈化柱 北京泰樂(lè)琪科技有限公司；高速冷凍離心機(jī) Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 A4-Prx酶液的制備 接種重組大腸桿菌BL21/pET31b/A4-Prx于LB培養(yǎng)基中（含50μg/m L氨芐青霉素），置于搖床培養(yǎng)（37℃，250r/m in）。待OD600值為0.5時(shí)，添IPTG，使其終濃度為0.5mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心收集細(xì)胞（10000×g，5m in）。用15m L，50mmol/ L的Tris-HCl緩沖液體（pH9.0）重懸，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞（4℃，200W，15m in），離心收集上清液（10000×g，5min）。

1.2.2 A4-Prx的酶學(xué)特性研究 以過(guò)氧化物酶活力測(cè)定方法[21]，測(cè)定不同pH、溫度和H2O2濃度下A4-Prx酶活。血紅素的含量采用吡啶高鐵血紅素法分析[21]。1m L吡啶-H2O-NaOH溶液（0.2mol/L NaOH溶液∶吡啶= 3∶2，體積比）和20μL 0.1mol/L鐵氰化鉀[K3Fe3（SCN）6]溶液混合均勻后，添加1m L A4-Prx酶液，漩渦混合1m in，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定549.5nm處的吸光值。1m L A4-Prx酶液和1m L去離子水混合作為參比對(duì)照。

1.2.3 A 4-Prx降解DDGS中ZEN的條件優(yōu)化 通過(guò)研究H2O2濃度、作用時(shí)間、溫度和料液比對(duì)降解玉米酒精糟中ZEN的影響等單因素實(shí)驗(yàn)后，設(shè)計(jì)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)[22]，見(jiàn)表1，優(yōu)化A4-Prx降解DDGS中ZEN的條件。選取H2O2濃度、作用時(shí)間、溫度和料液比DDGS∶A4-Prx四個(gè)因素，設(shè)計(jì)9組不同組合實(shí)驗(yàn)，從中篩選出最佳降解條件。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 DDGS中ZEN的降解實(shí)驗(yàn) 2g DDGS樣品中加0.3m L 2%（v/m）Na2CO3水溶液，再添加9m L A4-Prx酶液（料液比實(shí)驗(yàn)酶液需成倍增加），置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育6h后，加入2m L 0.1mol/L Tris-HCl（pH 9.0）及15m L乙腈，常溫旋渦振搖10m in，濾紙過(guò)濾。用PuriToxSR TC-M 160真菌毒素多功能凈化柱過(guò)濾5m L濾液，收集流出液體3m L于60℃下N2蒸發(fā)儀蒸干后用500μL流動(dòng)相溶解，溶解液用于高效液相色譜（HPLC）分析檢測(cè)ZEN的殘留量。HPLC條件：色譜柱采用Waters XTerraR MSC18柱（4.6×150mm，5μm）；流動(dòng)相為水∶乙腈∶甲醇=46∶46∶8；柱溫30℃；流量1m L/m in；進(jìn)樣量30μL；結(jié)果采用熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)270nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm[20]。設(shè)置對(duì)照組中，使用去離子水代替酶液。結(jié)果以相對(duì)降解率表示，計(jì)算公式如下：

相對(duì)降解率（%）=處理后DDGS中ZEN的含量（μg/kg）/對(duì)照組DDGS中ZEN的含量（μg/kg）×100

2 結(jié)果與討論

2.1 A4-Prx的酶學(xué)特性研究結(jié)果

圖1 不同pH對(duì)A4-Prx活力的影響（50℃）Fig.1 Effectof pH on the activity of A4-Prx（50℃）

圖2 不同溫度對(duì)A4-Prx活力的影響（pH8.5）Fig.2 Effectof temperature on the activity of A4-Prx（pH8.5）

圖3 不同H2O2濃度對(duì)A4-Prx活力的影響（50℃，pH8.5）Fig.3 Effectof H2O2 concentration on the activity of A4-Prx（50℃，pH8.5）

不同pH、溫度和H2O2濃度對(duì)重組過(guò)氧化物酶A4-Prx酶活的影響結(jié)果分別見(jiàn)圖1～圖3。研究結(jié)果表明，在中性及酸性條件下，A4-Prx的活力較低，堿性條件下，A 4-Prx有較強(qiáng)的活力，最高可達(dá)138U/m L，其最適pH為8.5；從30℃開(kāi)始，A4-Prx的活力隨著溫度的升高而增加，至75℃時(shí)達(dá)到最大，而后隨著溫度的升高開(kāi)始降低，其最適溫度為75℃；H2O2濃度在0～ 20mmol/L范圍內(nèi)，A4-Prx活力隨其升高而增大，當(dāng)H2O2濃度為20mmol/L時(shí)，其活力最大可達(dá)168U/m L，A4-Prx活力在H2O2濃度大于20mmol/L時(shí)有微弱降低，但是也穩(wěn)定在130U/m L。

2.2 DDGS中ZEN降解條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)ZEN降解的影響 固定降解時(shí)間6h，H2O2濃度20mmol/L，溫度40℃，分別選取料液比（g/m L）為1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5進(jìn)行ZEN降解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，A4-Prx酶液用量增加，有利于ZEN降解。但當(dāng)料液比超過(guò)1∶2后，ZEN降解率增加并不明顯，且用量過(guò)大會(huì)增加后續(xù)工藝的難度，能耗較高。因此從經(jīng)濟(jì)角度考慮，最適料液比為1∶2，且后續(xù)實(shí)驗(yàn)都采用此比例。

圖4 不同料液比對(duì)ZEN降解效果的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratios on ZEN degradation

2.2.2 時(shí)間對(duì)ZEN降解的影響 固定降解料液比為1∶2（g/m L），溫度40℃，H2O2濃度20mmol/L，分別選取降解時(shí)間1、3、6、9、12、15、18h進(jìn)行ZEN降解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為9h時(shí)，ZEN降解率約為80%；隨著時(shí)間增加，ZEN降解率最終保持平衡，為了提高實(shí)驗(yàn)效率，綜合選取9h為ZEN降解反應(yīng)最適時(shí)間。

圖5 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)ZEN降解效果的影響Fig.5 Effectof reaction times on ZEN degradation

2.2.3 H2O2濃度對(duì)ZEN降解的影響 固定降解料液比為1∶2（g/m L），時(shí)間9h，溫度40℃，分別選取H2O2濃度10、20、30、40、50、60mmol/L進(jìn)行ZEN降解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6。由于H2O2是A4-Prx氧化降解ZEN的必要成分，一定濃度的雙氧水能促進(jìn)ZEN降解[20]，在10～ 30mmol/L范圍內(nèi)，隨著H2O2濃度增大，ZEN降解率逐漸升高，當(dāng)H2O2濃度超過(guò)30mmol/L時(shí)ZEN的降解率開(kāi)始下降至穩(wěn)定，這與上述A4-Prx酶活受H2O2濃度影響結(jié)果一致，因此H2O2最佳濃度為30mmol/L。

圖6 不同H2O2濃度對(duì)ZEN降解效果的影響Fig.6 Effect of H2O2 concentrations on ZEN degradation

2.2.4 溫度對(duì)ZEN降解的影響 固定降解料液比為1∶2（g/m L），降解時(shí)間9h，H2O2濃度40mmol/L，分別選取反應(yīng)溫度30、40、50、60、70、80、90℃進(jìn)行ZEN降解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖7。在30～60℃范圍內(nèi)，隨著溫度逐漸增升高，ZEN降解率變大，當(dāng)溫度為60℃時(shí)，ZEN的降解率最大可達(dá)60%。溫度達(dá)到80℃時(shí)，A4-Prx活力開(kāi)始受到抑制[21]，ZEN的降解率開(kāi)始降低。故ZEN降解最佳溫度為60℃。

圖7 不同反應(yīng)溫度對(duì)ZEN降解效果的影響Fig.7 Effectof temperatures on ZEN degradation

2.3 正交法優(yōu)化降解條件的實(shí)驗(yàn)

通過(guò)上述單因素實(shí)驗(yàn)，按照表1中數(shù)據(jù)進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著這四個(gè)因素值的增大，ZEN降解率增大，且影響DDGS中ZEN降解率因素的主次順序?yàn)樽饔脮r(shí)間＞H2O2濃度＞溫度＞料液比，即在一定范圍內(nèi)，作用時(shí)間對(duì)ZEN降解率影響最大，其次是H2O2濃度、溫度，料液比影響最小。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A4-Prx對(duì)ZEN降解的最佳因素組合為：料液比1∶2（g/m L）、時(shí)間9h、H2O2濃度40mmol/L、溫度70℃。按照最佳實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)3次ZEN降解實(shí)驗(yàn)。結(jié)果測(cè)得ZEN降解率可達(dá)99.2%±0.2%。

表3列出了各因素方差平方和，它反映了正交實(shí)驗(yàn)中四個(gè)因素自身水平變化時(shí)所引起的結(jié)果差異，即各個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響，其中作用時(shí)間方差平方和最大，即它對(duì)ZEN降解影響最大；由于各因素方差平方和的大小與項(xiàng)數(shù)有關(guān)，不能確切反映各因素的情況，為了消除項(xiàng)數(shù)對(duì)結(jié)果的影響，表3中四個(gè)因素的均方結(jié)果也驗(yàn)證了作用時(shí)間為影響ZEN降解的主要因素，其次為H2O2濃度、溫度、料液比；F值的大小反映了各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響程度的大小，結(jié)果也顯示ZEN降解影響強(qiáng)弱順序?yàn)椋鹤饔脮r(shí)間＞H2O2濃度＞溫度＞料液比。由表3可知，在DDGS的ZEN降解實(shí)驗(yàn)中，作用時(shí)間、H2O2濃度、溫度三個(gè)因素對(duì)ZEN降解率的影響最為顯著，料液比對(duì)ZEN降解率的影響顯著性較弱。所以在ZEN降解中，要控制好作用時(shí)間、H2O2濃度、溫度。

表2 優(yōu)化DDGS中ZEN降解正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The orthogonal design for ZEN degradation optimization in DDGS

表3 方差分析表Table 3 ANOVA analysis

3 結(jié)論與討論

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 13078.2-2006中規(guī)定配合飼料中ZEN的最高檢出限為0.5mg/kg[26]；GB 2761-2011中規(guī)定食品（玉米、小麥）中的ZEN最高檢出限為60μg/kg[27]。但是，王若軍等[23-25]均報(bào)道飼料廠ZEN陽(yáng)性檢出率高達(dá)80%。此外，伴隨著燃料乙醇工業(yè)的巨大增長(zhǎng)，世界各國(guó)玉米產(chǎn)量也在迅速增長(zhǎng)[28]。玉米生產(chǎn)酒精過(guò)程中產(chǎn)生的DDGS，因其融入了糖化曲和酵母的營(yíng)養(yǎng)成分和活性成分，是近年來(lái)在畜禽飼養(yǎng)上應(yīng)用較多的高蛋白、高營(yíng)養(yǎng)飼料原料之一[8]。由于DDGS中殘留有較高含量ZEN，并且危害畜禽的生長(zhǎng)及繁殖性能[7]，從而帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立一種經(jīng)濟(jì)、可行的方法來(lái)解決DDGS中ZEN污染問(wèn)題勢(shì)在必行。

近年來(lái)，關(guān)于ZEN生物脫毒技術(shù)的研究取得了一定的進(jìn)展。ZEN可以被細(xì)菌、酵母菌及其他真菌等降解成為α和β玉米赤霉烯醇和其他代謝產(chǎn)物，但是它們?nèi)匀淮嬖诖萍に囟拘裕圆⒉皇钦嬲饬x上的脫毒[29]。然而，重組過(guò)氧化物酶A4-Prx已被證實(shí)有降解ZEN毒素的功能，并且可以將ZEN完全轉(zhuǎn)化為無(wú)毒產(chǎn)物[19-20]。在前期研究基礎(chǔ)上，本論文探究了A4-Prx酶學(xué)特性，并且優(yōu)化了影響DDGS中ZEN降解率的條件。結(jié)果表明，A4-Prx的酶活受pH、溫度和H2O2濃度的影響，且最適pH8.5、最適溫度75℃、最適H2O2濃度25mmol/L。目前，大多數(shù)過(guò)氧化物酶均具有血紅素依賴性，包括辣根過(guò)氧化物酶、大豆過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶等，而其最適pH多在5左右，而A4-Prx的最適pH為8.5，并且它屬于非血紅素依賴的過(guò)氧化物酶。另外，A4-Prx降解DDGS中ZEN的最佳工藝條件組合為：H2O2濃度40mmol/L，料液比1∶2（g/m L），溫度70℃，時(shí)間9h。在此工藝條件下，DDGS中ZEN的降解率可達(dá)到99.2%，降解率比優(yōu)化前提高了19%左右。A4-Prx氧化降解DDGS中ZEN毒素更徹底，且條件溫和、對(duì)飼料的營(yíng)養(yǎng)成分破壞更少，因此，它為ZEN污染飼料以及飼料原料的脫毒實(shí)現(xiàn)工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)，也將促進(jìn)ZEN脫毒技術(shù)研究的發(fā)展。

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Study on characterization of a recombinant peroxidase A4-Prx and its ZEN detoxification in DDGS

WU Hui1，XIAO Jun-mei1，CHEN Yi1，YU Yuan-shan2，CHEN Shen-liang1，TANG Yu-qian1，*
（1.College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；
2.Sericulture and Agro-food Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510610，China）

The enzymatic characteristics of the recombinant peroxidase Acinetobacter sp.SM 04（A4-Prx）was stud ied.Firstly，the effec t of pH，tem perature and H2O2concentration on peroxidase A4-Prx activity were stud ied.Then，the orthogonal experiment was designed to receive the op timal ZEN（zearalenone）deg radation rate of A4-Prx in DDGS（d ried distillers’grains and solub le）.The A4-Prx characterization result showed that it was an alkaline and p rotoheme independent peroxidase，and the op timal pH value，tem perature and H2O2concentration for peroxidase A4-Prx activity were pH8.5，75℃ and 25mmol/L respectively.And the op timum cond ition for ZEN decontam ination were as follows：40mmol/L H2O2，9h，70℃ and 1∶2（solid-liquid ratio，g/m L）. Under the op timum cond ition，ZEN deg radation rate was 99.2%±0.2%.

peroxidase；enzymatic characteristics；zearalenone；DDGS；biodetoxification；orthogonalexperiment

TS201.3

A

1002-0306（2012）20-0213-05

2012－04－10 *通訊聯(lián)系人

吳暉（1967-），男，博士，教授，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

廣東省大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（S1010561065）；華南理工大百步梯攀登計(jì)劃研究項(xiàng)目（DA2091015）；華南理工大學(xué)2012“學(xué)生研究計(jì)劃”（SRP）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201330）。