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    間接熒光法測定水產(chǎn)品中L-谷胱甘肽的含量

    2012-10-25 07:43:46潘煜辰陳舜勝趙善貞
    食品工業(yè)科技 2012年20期
    關(guān)鍵詞:熒光法定容谷胱甘肽

    潘煜辰,陳舜勝,*,宋 青,趙善貞

    (1.上海海洋大學(xué),上海 201306;2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局,上海 200135)

    間接熒光法測定水產(chǎn)品中L-谷胱甘肽的含量

    潘煜辰1,陳舜勝1,*,宋 青2,趙善貞2

    (1.上海海洋大學(xué),上海 201306;2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局,上海 200135)

    建立了間接熒光法測定水產(chǎn)品中L-谷胱甘肽(GSH)含量的方法。樣品經(jīng)三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白,調(diào)上清液pH至10.5同時(shí)二次沉淀蛋白,提取液稀釋一定倍數(shù)后以鄰苯二甲醛(OPA)為熒光衍生劑,等體積(1∶1,v∶v)暗處混合反應(yīng)1~2min,在Ex 325nm和Em 400nm條件下測得總熒光值A(chǔ)。同時(shí)以N-乙基馬來酰亞胺(NEM)屏蔽待測液中含巰基的化合物,測得雜質(zhì)產(chǎn)生的熒光值B,以總熒光值A(chǔ)減去熒光值B,得出GSH所產(chǎn)生的熒光值,間接測得GSH含量。在0.125~1.250mg/L濃度范圍內(nèi)GSH線性關(guān)系良好,R2=0.9963,回歸方程為Y=57.012X。該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.83%~5.25%,平均回收率為91.37%~102.20%。改進(jìn)后的方法彌補(bǔ)了熒光法本身特異性不高的缺點(diǎn),使得測定更精確,適用于水產(chǎn)品中L-谷胱甘肽含量的測定。

    L-谷胱甘肽,間接熒光校正法,牡蠣,蠔油

    L-谷胱甘肽(GSH),又稱還原型谷胱甘肽,是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵縮合而成的三肽化合物,是一種用途廣泛的活性短肽,廣泛存在于動(dòng)植物中,在酵母、胚芽和動(dòng)物肝臟中的含量極高[1]。目前,L-谷胱甘肽的主要檢測方法[2-3]有酶循環(huán)法、電化學(xué)法、熒光法和高效液相色譜法(HPLC)等。其中,酶循環(huán)法[4]雖然廉價(jià),但如果待測體系中存在氧化型谷胱甘肽(GSSG),則該方法測得的是總谷胱甘肽的量,無法單獨(dú)測定GSH的含量;電化學(xué)法[5-6]的靈敏度很高,是唯一一種不需要對GSH進(jìn)行衍生化就可測得其含量的方法,但是很多電極在長時(shí)間使用后,其表面被氧化,穩(wěn)定性和靈敏度都會(huì)下降,而且多數(shù)電極的價(jià)格相當(dāng)昂貴;HPLC法[7-9]具有良好的分離能力,但樣品的前處理復(fù)雜耗時(shí),所用的柱也較為特殊,且流動(dòng)相多采用磷酸鹽緩沖液,有的還添加離子對試劑三氟乙酸(TFA),對柱子損害較大、不易保護(hù)[1]。有人用熒光法檢測了海藻[10]、大豆[11]、對蝦等海洋生物[12]、黃瓜[13]中的GSH,還有研究者采用熒光增強(qiáng)劑[14-15]來加強(qiáng)熒光信號。然而,熒光法雖然快速簡便,但其本身存在特異性不高的缺點(diǎn),含有巰基的化合物(如半胱氨酸)或雜質(zhì)會(huì)干擾測量[16]等。因此,本實(shí)驗(yàn)對熒光法測定水產(chǎn)品中L-谷胱甘肽含量的方法進(jìn)行了改進(jìn)。改進(jìn)后的熒光法保持了原有快速簡便,衍生1~2m in即可測定,且具有能保持30m in左右的穩(wěn)定性,靈敏度也較高等優(yōu)點(diǎn),同時(shí)也排除了半胱氨酸和其他雜質(zhì)的干擾,彌補(bǔ)了其特異性不高的缺點(diǎn),提高了測定的準(zhǔn)確度。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    太平洋牡蠣,珠江牡蠣,太平洋蠔水(汁),珠江蠔水(汁),市售蠔油;鄰苯二甲醛(OPA)、磷酸氫二鈉、三氯乙酸(TCA) 日本和光純;氫氧化鈉 國藥集團(tuán);N-乙基馬來酰亞胺(NEM)、谷胱甘肽(GSH)標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司。

    RF-1501熒光分光光度計(jì) 日本島津;離心機(jī)無錫瑞江分析儀器;分析天平、pH計(jì) 梅特勒-托利多公司。

    1.2 樣品前處理

    稱取已搗碎的牡蠣、蠔水、蠔汁和蠔油各10g,分別加入10%TCA溶液各10m L,混勻并倒入離心管,加一定量的蒸餾水,高速離心10min(5000r/min),倒出上清液,加水至90m L左右,用NaOH調(diào)pH至10.5同時(shí)二次沉淀蛋白,分2個(gè)50m L離心管再次離心10min(5000r/m in),合并上清液,加少量蒸餾水定容至100m L,作為提取液。

    對于蠔水、蠔汁和蠔油提取液:移取2份各1m L提取液,其中一份直接定容至100m L,作為待測液;另一份先加入1m L濃度為0.5%的NEM溶液,再定容至100m L(定容過程的最后需將pH調(diào)至10.5),作為空白液。

    對于牡蠣提取液:移取2份各5m L牡蠣提取液,其中一份直接定容至50m L,作為待測液;另一份先加入1m L濃度為0.5%的NEM溶液,再定容至50m L(定容過程的最后需將pH調(diào)至10.5),作為空白液。

    1.3 定量分析

    將樣品待測液、空白液分別與OPA按照1∶1的比例混合,搖勻,暗處反應(yīng)1~2min,轉(zhuǎn)移至比色皿中,放入熒光分光光度計(jì),在激發(fā)波長325nm和發(fā)射波長400nm條件下測定熒光值A(chǔ)和B,以A與B的差值作為GSH所發(fā)出的熒光強(qiáng)度,從而定量。

    1.4 GSH標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

    GSH標(biāo)準(zhǔn)系列溶液:精確稱取谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg,用pH為10.5的磷酸氫二鈉緩沖液定容至100m L,即為100mg/L的GSH儲備液,再分別吸取一定量的儲備液于50m L容量瓶中,用緩沖液定容得0.125、0.250、0.500、0.750、1.000、1.250mg/L 5個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 半胱氨酸對測定的影響及熒光波長的選擇

    以1.4中所配制的GSH標(biāo)準(zhǔn)液,在熒光光度計(jì)上掃描200~500nm波長范圍,得最大激發(fā)波長Ex為346nm,最大發(fā)射波長Em為420nm。

    半胱氨酸(Cys)是20種基本氨基酸中唯一一種含有巰基(-SH)的氨基酸,而OPA與GSH的結(jié)合位點(diǎn)正為巰基,所以半胱氨酸的存在可能會(huì)對GSH的定量產(chǎn)生影響,使其測定值偏高,導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

    分別吸取濃度均為100mg/L的GSH和Cys儲備液0.5m L置于2個(gè)容量瓶中,以磷酸緩沖液定容至50m L,分別形成1mg/L的GSH和Cys標(biāo)準(zhǔn)溶液;再吸取2種儲備液各0.5m L,混合于同一容量瓶,用磷酸緩沖液定容至50m L,形成濃度為1mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液。對三種待測液同時(shí)在上述熒光波長下進(jìn)行熒光值的測定。

    結(jié)果表明,1mg/L的谷胱甘肽和半胱氨酸與OPA結(jié)合后所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度之和與1mg/L的兩者混合標(biāo)準(zhǔn)溶液所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度相近(見表1),說明若待測液中含有半胱氨酸,則會(huì)對谷胱甘肽的定量測定產(chǎn)生影響,所以實(shí)驗(yàn)中需要調(diào)整測定時(shí)的激發(fā)波長和發(fā)射波長,以使得在某一特定條件下,半胱氨酸的熒光強(qiáng)度為0,而谷胱甘肽的熒光強(qiáng)度較大,以提高測定的準(zhǔn)確度。

    表1 Cys對GSH檢測的干擾Table 1 Cys’s interference to determination of GSH

    配制一定濃度的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,同樣在熒光光度計(jì)上掃描200~500nm波長范圍,得半胱氨酸的最大激發(fā)波長Ex為335nm,最大發(fā)射波長Em為455nm。然后,經(jīng)多次對波長進(jìn)行調(diào)整后,確定了實(shí)驗(yàn)中的熒光條件為Ex:325nm和Em:400nm,此時(shí)半胱氨酸的熒光強(qiáng)度剛好為0,對實(shí)驗(yàn)不會(huì)產(chǎn)生干擾,而谷胱甘肽的熒光強(qiáng)度降低為56.74。

    2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性相關(guān)系數(shù)

    按照1.3的方法,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),熒光強(qiáng)度(FI)為縱坐標(biāo),在確定的熒光波長下對谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行熒光值的測定:在0.125~1.250mg/L濃度范圍內(nèi),谷胱甘肽具有較好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2為0.9963,回歸方程為Y=57.012X。

    2.3 溶液體系的pH對測定的影響

    分別吸取0.5m L濃度為100mg/L的谷胱甘肽儲備液置于9個(gè)容量瓶中,加約40m L蒸餾水,用一定濃度的NaOH溶液將其pH分別調(diào)至8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5和12.0,再加少量蒸餾水定容至50m L(忽略pH的變化),最終形成9種不同pH、濃度均為1mg/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定其熒光強(qiáng)度,結(jié)果見圖1。

    圖1 1mg/LGSH溶液在不同pH體系中的熒光強(qiáng)度Fig.1 The fluorescence intensity of 1mg/LGSH at different pH

    由圖1可見,當(dāng)溶液的pH為10.5時(shí),由于GSH和OPA的結(jié)合程度最大,結(jié)合的穩(wěn)定性也最好,因而體系所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度最強(qiáng),熒光值為56.72,所以實(shí)驗(yàn)確定10.5為測定谷胱甘肽含量的最佳pH。

    2.4 雜質(zhì)干擾的消除

    N-乙基馬來酰亞胺(NEM)能與蛋白質(zhì)、氨基酸中的巰基結(jié)合發(fā)生不可逆反應(yīng),因此在本研究中采用NEM作為巰基掩蔽劑來阻止GSH與OPA進(jìn)行結(jié)合,從而可測得其他雜質(zhì)與OPA結(jié)合后所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度,進(jìn)而消除雜質(zhì)所帶來的影響。

    在1.00mg/L GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液里加入1m L濃度為0.5%的NEM溶液,按照1.3的方法進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測定,結(jié)果表明,未加掩蔽劑前GSH標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度為61.72(表1),而加入NEM后所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度僅為0.64,足足降低至約原來的1/100,說明NEM具有良好的掩蔽作用,可用于在本實(shí)驗(yàn)中屏蔽GSH含有的巰基。

    2.5 精密度及回收率

    2.5.1 精密度測定 準(zhǔn)確稱取7份太平洋牡蠣各10.0g,按照1.2和1.3的方法以及參照2.2的標(biāo)準(zhǔn)曲線,對樣品待測液中的GSH濃度進(jìn)行測定,平行7次,并計(jì)算RSD,結(jié)果見表2。

    表2 精密度測定結(jié)果(n=7)Table 2 Precision of themethod(n=7)

    2.5.2 回收率實(shí)驗(yàn) 根據(jù)表2的測定結(jié)果可推得,太平洋牡蠣中GSH的含量約為0.0182mg/g,因此樣品的加標(biāo)量選為0.1、0.2、0.3mg,即在樣品中分別加入10m L濃度為10、20、30mg/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液,對每一加標(biāo)濃度,均進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn),并計(jì)算RSD。

    加標(biāo)回收率(%)=(加標(biāo)測定值-樣品測定值)/加標(biāo)量×100;結(jié)果見表3。

    表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)(n=5)Table 3 Recovery and relative standard deviation of themethod(n=5)

    2.6 7種水產(chǎn)品中GSH含量的測定

    依據(jù)1.2和1.3的方法,對7種水產(chǎn)品中的GSH含量進(jìn)行了測定,結(jié)果如表4所示,GSH在牡蠣中的含量在15~18.5mg/kg;在蠔水和蠔汁中則高達(dá)255~ 322mg/kg,約為牡蠣中的17倍;在市售蠔油中的含量為149mg/kg,約為蠔水、蠔汁的1/2。這是由于蠔水和蠔汁是對牡蠣通過加熱的方式進(jìn)行處理后的濃縮液,而市售蠔油則是在上市之前通過對蠔水和蠔汁進(jìn)行稀釋并添加其他作料而制成的成品。所以,GSH在這3類樣品中的含量順序?yàn)椋合査拖栔鞠栍停灸迪牎?/p>

    表4 7種水產(chǎn)品中GSH的含量(mg/kg)Table 4 The content of GSH in 7marine products(mg/kg)

    3 結(jié)論

    采用間接熒光法,以O(shè)PA為衍生劑,實(shí)驗(yàn)中調(diào)整了熒光法測定時(shí)的激發(fā)波長和發(fā)射波長,以消除半胱氨酸對谷胱甘肽測定的干擾。其次確定了10.5為測定谷胱甘肽含量的最佳pH,在測得樣品中總熒光強(qiáng)度的基礎(chǔ)上,以NEM掩蔽了GSH以得出雜質(zhì)的干擾值,并予以排除,進(jìn)而間接測得GSH的含量,實(shí)驗(yàn)最后對7種水產(chǎn)品中的谷胱甘肽含量進(jìn)行了定量,獲得滿意的結(jié)果。該方法彌補(bǔ)了熒光法本身特異性不高的缺點(diǎn),同時(shí)又保留了其快速、靈敏度高等諸多優(yōu)點(diǎn),提高了測量的精準(zhǔn)度,適用于水產(chǎn)食品中L-谷胱甘肽含量的測定。

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    Determ ination of L-glutathione in marine products by the method of indirect fluorescence

    PAN Yu-chen1,CHEN Shun-sheng1,*,SONG Qing2,ZHAO Shan-zhen2
    (1.ShanghaiOcean University,Shanghai201306,China;
    2.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shanghai200135,China)

    The method of ind irect fluorescence was developed to the determ ination of L-g lutathione(GSH)in marine p roducts.The p rotein in p roducts was p recip itated by TCA,then the pH of supernatantwas ad justed to 10.5,during which the p rotein was p recipitated again.OPA was used as derivatization agent to be m ixed w ith extraction liquid(1∶1,v∶v),which had been diluted,and then total fluorescence intensity(FIA)was determ ined at Ex 325nm and Em 400nm after reacting for 1~2m in in the dark.Meanwhile,F(xiàn)IB em itted by impurity was determ ined after using NEM to screen all the compounds with sulfyd ryl.FI em itted by GSH was known by deduc ting FIB from FIA,then GSH was determ ined ind irectly.Its fluorescence intensity was linear to GSH concentration in the range of 0.125~1.250mg/L,R2=0.9963,reg ression equation was Y=57.012X.The GSH in three sam p les was determ ined w ith RSD ranged from 3.83%~5.25%as well as average recovery ranged from 91.37%~102.20%.The poor specificity of fluorescence method was made up by the method of ind irec t fluorescence w ith higher p recision which could be app lied to the determ ination of GSH in marine p roducts.

    L-g lutathione;correction method of indirect fluorescence;oyster;oyster sauce

    TS207.3

    A

    1002-0306(2012)20-0070-04

    2012-07-14 *通訊聯(lián)系人

    潘煜辰(1987-),男,碩士研究生,研究方向:食品檢測與分析。

    國家科技支撐計(jì)劃課題(2006BAD05A18);上海檢驗(yàn)檢疫局課題(HK067-2011)。

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